本发明专利技术公开了DNA片段，由序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成。本发明专利技术还公开了含有外源多核苷酸的重组载体，包含原始载体以及HSP70‑MLAA34融合基因。本发明专利技术还公开了构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，利用序列表中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的HSP‑70基因，利用序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.7所示的碱基序列的MLAA‑34基因，以HSP‑70基因和MLAA‑34基因为模板，利用序列表中的SEQ ID NO.2和序列表中的SEQ ID NO.6所示的引物序列，扩增得到序列表中的SEQ ID NO.1所示的HSP70‑MLAA34融合基因，将HSP70‑MLAA34融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。本发明专利技术还公开了包含HSP70‑MLAA34融合基因的转染细胞。
【技术实现步骤摘要】
DNA片段与含有该片段的重组载体、构建重组载体的方法及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及DNA片段与含有该片段的重组载体、构建重组载体的方法及其应用。
技术介绍
急性白血病是一种比较常见的血液系统恶性肿瘤，是人类致死的主要原因之一。近年来，随着联合化疗和造血干细胞移植技术的发展，使得白血病及其它血液系统肿瘤的预后不断改善，然而由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除，疾病复发率及死亡率较高。研究发现，核酸疫苗能够激发白血病患者特异性免疫应答，清除化疗后残余肿瘤细胞，是有望克服MRD的方法之一。Padua等将人类早幼粒细胞白血病的PML-RARα融合基因与破伤风毒素基因的C片段序列融合，证实以融合蛋白为特异性靶点的核酸疫苗可以显著提高患病动物的生存率。MLAA-34基因是与急性单核细胞白血病(AML-M5)发生密切相关的一个新的抗凋亡分子，MLAA-34基因表达下调能显著抑制U937细胞在体外的增值，同时会诱发白血病细胞的凋亡，并与AML-M5的低生存率等不良预后密切相关，是急性白血病的新肿瘤标志物及基因免疫治疗的靶基因。MLAA-34蛋白是胞内蛋白，如何有效递呈MLAA-34蛋白至白血病细胞膜表面从而持续诱导机体产生特异性细胞免疫并成为效应细胞毒性T细胞(CTL)的靶向分子，是疫苗能否发挥抗白血病作用的关键。HSP70与肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫和肿瘤的预后等都有密切关系，其具有抗原递呈功能，能将肿瘤细胞内的抗原信息传递至细胞膜上，进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，且其诱导的免疫应答可不受MHC限制，可以起到很好的抗肿瘤免疫效应，从而起到杀灭肿瘤细胞的作用。此外，关于核酸疫苗能否整合到宿主基因组上的安全性问题一直备受关注。研究表明，免疫方式对DNA疫苗的整合安全性有很大影响，电穿孔免疫方式会导致基因组整合现象，而肌肉注射和基因枪(genegun)免疫方式较为安全，核酸疫苗的质粒DNA是以染色体外附加子的形式存在，而不是整合到宿主染色体DNA上。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的之一是提供一组DNA片段。本专利技术的专利技术目的之二是提供包括上述DNA片段的重组载体。本专利技术的专利技术目的之三是提供构建上述重组载体的方法。本专利技术的专利技术目的之四是提供通过上述重组载体进行基因疫苗的制备。本专利技术提供的技术方案为：DNA片段，由序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列组成。含有外源多核苷酸的重组载体，包含原始载体以及HSP70-MLAA34融合基因；其中，所述融合基因包含序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。优选的是，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，包括：步骤一、利用序列表中的SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQIDNO.4所示的碱基序列的HSP-70基因；利用序列表中的SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQIDNO.7所示的碱基序列的MLAA-34基因；步骤二、以HSP-70基因和MLAA-34基因为模板，利用序列表中的SEQIDNO.2和序列表中的SEQIDNO.6所示的引物序列，通过SOE-PCR扩增得到序列表中的SEQIDNO.1所示的HSP70-MLAA34融合基因，并且使其含有EcoRI和BamHI酶切位点；步骤三、将步骤二所述的HSP70-MLAA34融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。优选的是，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。优选的是，包括如权利要求3所述的重组载体以及U937细胞。优选的是，其转染方法包括如下：取U937细胞进行培养并收集对数生长期的细胞进行接种，另取两份培养基，在其中一份培养基中加入转染试剂，在另一份中加入含有HSP70-MLAA34融合基因的重组载体，将两份培养基混合均匀，将混合均匀后的转染复合物加入到细胞中，混合均匀，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养18～48小时；其中，转染4～6小时后可换新鲜培养基。优选的是，所述转染细胞进行转染方法包括如下：步骤a、取U937细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次，取对数生长期的细胞进行试验；步骤b、收集U937细胞并调整细胞浓度至2×105/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔加U937细胞100μL；步骤c、用50μL的Opti-MEM培养基稀释0.8μg含有HSP70-MLAA34融合基因重组载体，轻轻吹吸3～5次混匀；步骤d、轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μL的Opti-MEM培养基稀释2.0μL的LipofectamineTM3000转染试剂，轻轻吹吸3～5次混匀，室温下静置5分钟；步骤e、混合所述步骤c的含有重组载体的培养和所述步骤d的转染试剂，轻轻吹吸3～5次混匀，室温下静置20分钟，得到转染复合物；步骤f、将所述转染复合物加入到24孔细胞板中，100μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀；步骤g、将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时；其中，转染4～6小时后可换新鲜培养基。使用包括所述的重组载体制备基因疫苗，所述重组载体包含序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。本专利技术与现有技术相比较所具有的有益效果：1、核酸疫苗导入宿主体内后可被抗原提呈细胞或机体组织细胞摄取，在细胞内表达蛋白抗原，刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫保护作用好；2、通过SOE-PCR技术在设计引物时，重叠序列可以是基因序列上的任意位点，不需要考虑融合位点及其附近特殊序列，通过特定的重叠互补序列的引物作为桥梁，从而使PCR扩增产物末端形成了相同的重叠链，通过重叠链的延伸将PCR扩增片段拼接起来，从而将两个目的基因融合在一起，相比于限制性内切酶的酶切和连接酶的连接更加简便快捷。附图说明图1为SOE-PCR法扩增HSP70-MLAA34融合基因经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，1为分子量标记，2为HSP70-MLAA34融合基因，3为HSP70基因，4为MLAA34基因。图2为pIRES2-HSP70-MLAA34重组质粒经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，1为分子量标记，2为pIRES2-HSP70-MLAA34重组质粒，3为双酶切鉴定结果，4为PCR鉴定结果。图3为验证基因凝胶电泳图像；其中，1为分子量标记，2为pIRES2-EGFP质粒转染U937细胞，3为pIRES2-HSP70-MLAA34重组质粒转染U937细胞，4为验证基因转染U937细胞。图4为目的蛋白在U937细胞内表达检测图。图5为目的蛋白在U937细胞内表达成像分析图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术中的“重组载体”是指已连接了基因的表达载体，可交互使用“重组质粒”、“重组载体”和“核酸疫苗”。实验材料和仪器1、质粒和细胞U937细胞购自中科院上海细胞库；pIRES2-EGFP质粒购自addgene公司。2、动物BALB/c鼠[无特定病原体(SPF)级，雌性，6～8周龄]购自北京维通利华实验动物技术有限公司3、试剂、酶与药品噻唑蓝本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA片段，其特征在于，由序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成。
【技术特征摘要】
1.DNA片段，其特征在于，由序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列组成。2.含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于，包含原始载体以及HSP70-MLAA34融合基因；其中，所述融合基因包含序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。4.构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，其特征在于，包括：步骤一、利用序列表中的SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQIDNO.4所示的碱基序列的HSP-70基因；利用序列表中的SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQIDNO.7所示的碱基序列的MLAA-34基因；步骤二、以HSP-70基因和MLAA-34基因为模板，利用序列表中的SEQIDNO.2和序列表中的SEQIDNO.6所示的引物序列，通过SOE-PCR扩增得到序列表中的SEQIDNO.1所示的HSP70-MLAA34融合基因，并且使其含有EcoRI和BamHI酶切位点；步骤三、将步骤二所述的HSP70-MLAA34融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。5.如权利要求4所述构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，其特征在于，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。6.包含HSP70-MLAA34融合基因的转染细胞，其特征在于，包括如权利要求3所述的重组载体以及U937细胞。7.如权利要求6所述的转染细胞，其转染方法包括如下：取U937细胞进行培养并收集对数生长期的细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵臣，赵阳，赵佳琪，袁忠海，侯毅鞠，李广庆，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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