重组枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白制造技术

本发明专利技术涉及串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明专利技术成功构建了禽流感病毒HA‑PB1‑F2蛋白重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒plnHAPB1‑F2，并成功化学转化和电击转化入枯草芽孢杆菌WB600。经Western‑blot验证串联表达的禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫一日龄SPF雏鸡后，可以刺激鸡体产生有效HA‑PB1‑F2特异性免疫应答水平，同时显著增强非特异性免疫。重组枯草芽孢杆菌有望成功开发成预防家禽高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

Recombinant Bacillus subtilis series expression of avian influenza virus HA Antigen Fragment and PB1F2 protein

The present invention relates to a series expression of avian influenza virus HA Antigen Fragment of F2 protein and PB1 recombinant Bacillus subtilis, which belongs to the biotechnology field of genetic engineering. The present invention successfully constructed PB1 recombinant avian influenza virus HA F2 protein of Bacillus subtilis integration plasmid plnHAPB1 F2, and the success of the chemical transformation and electroporation into Bacillus subtilis WB600. The Western blot series validation expression of avian influenza virus HA Antigen Fragment and PB1 F2 protein in recombinant Bacillus subtilis can be successfully expressed. Oral immunization of 1-day-old SPF chickens, can stimulate the chicken body to produce effective HA PB1 F2 specific immune response level, and significantly increase the non-specific immune. Recombinant Bacillus subtilis is expected to be successfully developed as a genetic engineering oral vaccine for preventing highly pathogenic avian influenza in poultry.

【技术实现步骤摘要】
重组枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白一、
本专利技术涉及串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体包括：禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白整合表达性质粒pInHAPB1的构建，禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白的表达与鉴定以及重组枯草芽孢杆菌可以刺激鸡骨髓源树突状细胞MHC11的表达发生显著变化，诱导树突状细胞的成熟；也可以刺激SPF雏鸡机体产生有效的HA-PB1-F2特异性免疫应答水平。二、
技术介绍
1口服黏膜免疫研究进展目前，在我国控制禽流感最实际有效的方法是使用全病毒灭活疫苗。原因是具有良好的安全性，抗原成分齐全和免疫原性强等特点。但是，传统的疫苗接种(肌肉或皮下注射)具有以下缺点：①动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养，这使得疫苗生产的成本非常高；②疫苗中的病原体可能在疫苗生产过程中没有完全被杀死或完全减毒，从而导致疾病更大范围的扩散；③减毒菌株可能发生突变；④有些疾病使用传统疫苗控制效果不佳(如艾滋病)；⑤导致家禽的应激反应从而影响动物的生长；⑥传统疫苗如果多次接种，会造成体内疫苗残留导致肉类产品质量下降，间接影响食品安全和公共卫生；⑦禽流感感染主要通过呼吸道和胃肠道途径，通过肌肉注射动物的灭活油乳剂疫苗，不能刺激呼吸道和消化道局部粘膜免疫。新兴的粘膜免疫，具有简单，安全，方便等许多优点，引起国内外免疫学专家的关注，现已成为免疫学研究的热点之一。一方面，粘膜免疫方法简单安全，不仅在粘膜局部和其他粘膜组织产生免疫反应，而且还能引起全身性体液免疫反应；另一方面，有显著的免疫效果，疫苗在口服免疫后通过上呼吸道粘膜相关淋巴组织不仅有效地诱导局部免疫反应，而且激活淋巴细胞归巢到其他粘膜部位，诱导广泛的粘膜免疫应答，防御病原微生物入侵，因此通过口服粘膜免疫能够获得好的效果。例如，口服脊髓灰质炎疫苗的应用，使得脊髓灰质炎的全球发病率得到了有效控制，为口服疫苗的开发和应用起到了引导作用。然而，在实践中，口服粘膜免疫也存在不足，由于疫苗仅作用在粘膜表面，很少能有效地进入动物体，同时也受到膜表面粘液和其他等因素的影响，特别是在经过消化道粘膜时，疫苗很容易被破坏，影响免疫效果，这使得消化道粘膜免疫的使用和推广得到了限制。近年来，疫苗递送已成为传染病防御领域的热点之一。特别是细菌活载体疫苗因培养方便，外源基因容量大，能刺激细胞免疫力的优势具有较大潜力。因此，理想的疫苗抗原载体的选择是建立新的生物技术的关键。理想的抗原递送载体应该能够在体内长时间存在，本身是安全的并且可以产生持续免疫力。2枯草芽孢杆菌对口服黏膜免疫的影响近年来，疫苗递送系统已成为预防传染病领域的热点之一。特别是细菌活载体疫苗因其培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫等优点具有巨大的潜力。细菌活载体疫苗是新兴的粘膜免疫疫苗的重要发展方向。通过使用细菌活载体疫苗，不仅能刺激肠道免疫反应，而且能够针对特异性抗原产生特异性免疫反应，使机体得到全面保护。目前，研究比较广泛的活菌载体有沙门氏菌、乳杆菌、李斯特菌等。枯草芽孢杆菌是一种安全和非致病的活细菌载体，广泛存在于土壤和植物中，许多研究表明，枯草芽孢杆菌不仅可以诱导肠粘膜免疫应答，也对动物和人的病原体有拮抗作用。作为抗原载体的枯草芽孢杆菌具有许多优点：①是一种安全非致病的益生菌；②有良好的安全性，抗逆性强(适合保存和运输)；③生产方便(发酵条件简单，产品易于分离和纯化)；④遗传操作系统成熟。因此，枯草芽孢杆菌非常适合用于安全口服疫苗和其它病原体的抗原递送载体。同时，作为抗原递送载体的枯草芽孢杆菌可以诱导粘膜免疫应答和全身免疫应答，这都使得应用枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体具有广阔的前景。3枯草芽孢杆菌对树突状细胞的影响使用益生菌——枯草芽孢杆菌做为活细菌载体具有一箭双雕的作用。枯草芽孢杆菌不仅能诱导肠道粘膜免疫反应，还能够对病原菌产生拮抗。鸡的呼吸道和消化道黏膜下广泛分布有天然免疫细胞-树突状细胞，时刻监视病原微生物的入侵。当遇到入侵的病原体时，DCs则伸出许多树突状或伪足样突起通过上皮细胞之间的连接摄取外界抗原，对抗原进行加工处理后迁移到附近的淋巴结呈递给淋巴细胞，诱导免疫反应。枯草芽孢杆菌是与鸡DCs的表面受体TLR2和TLR4结合，通过诱导DCs的成熟提高机体局部免疫力。并且枯草芽孢杆菌在肠道内能够具有完整的生活周期，枯草芽孢杆菌在极端条件下能自动生成芽孢形式存在，一旦外界条件适合生长就会从芽孢状态大量繁殖。因此使枯草芽孢杆菌表面展示高致病性HA蛋白和PB1-F2蛋白作为鸡肠道基因工程菌具有非常广阔的应用前景。近年来，枯草芽孢杆菌在表达酶和抗原方面取得了很多进展。马海等应用枯草芽孢杆菌成功串联表达O型口蹄疫病毒的复合表位与霍乱毒素B单位；牟春晓等应用枯草芽孢杆菌成功表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白；Hinc等应用枯草芽孢杆菌成功表达幽门螺杆菌UreA蛋白。4H5N1结构蛋白HA蛋白和PB1-F2蛋白流感病毒对世界各地人类和动物的健康构成极大地威胁，是A型流感病毒。近年来，禽流感的爆发范围非常广泛，并且高频爆发，每次爆发都造成大量家禽染病死亡或者遭到捕杀，对中国和世界的家禽业造成巨大的经济损失。禽流感病毒可以编码多达16种蛋白质，感染多种宿主，包括人，鸟，马，狗，猪等。我国是养殖业大国也是人口大国，因此有效快速找到预防禽流感的方法迫在眉睫。预防禽流感病毒需要具有针对流感病毒的特异性抗体，表面血凝素蛋白HA蛋白在病毒吸附，与细胞融合，侵袭粘膜上皮细胞过程中起决定性作用，也是中和抗体的主要靶标。病毒通过HA糖蛋白将唾液酸锚定到宿主细胞的表面受体，然后通过细胞网格蛋白或小窝蛋白介导的细胞内吞作用进入细胞。近年来，禽流感病毒HA基因已被用于制备禽流感DNA疫苗和禽流感病毒HA基因重组禽痘疫苗，并获得好的免疫效果。随着益生菌作为抗原递送的载体，能有效刺激粘膜免疫这一技术的提升，本专利技术使用枯草芽孢杆菌表达HA蛋白对抵抗禽流感病毒有重要的意义。PB1-F2蛋白是流感病毒表达的第11个蛋白，能够影响流感病毒的毒性，是病毒毒力的一个重要因素，H5N1亚型的高致病性禽流感病毒蛋白之一。PB1-F2基因是流感病毒第2片段编码，由87-90个氨基酸残基组成，是流感病毒的PB1基因序列的可替代开放阅读框编码的非结构辅助蛋白。许多研究表明PB1-F2可引起许多不同的效应，例如上调病毒聚合酶活性；增强炎症；通过与线粒体抗病毒信号蛋白MAVS相互作用来抑制IFN途径的诱导；促进继发性细菌感染。PB1-F2蛋白诱导细胞凋亡机制主要与PB1-F2的线粒体定位有关。PB1-F2的线粒体定位通过线粒体靶向序列实现，该序列C末端的富含短的α-螺旋精氨酸的序列。来自Bcl-2家族细胞前体蛋白BAX/BAK的活化是与线粒体外膜相互作用，刺激VDAC1开放并诱导细胞凋亡；另一种诱导细胞凋亡机制是PB1-F2蛋白本身并没有细胞毒性当其形成β-折叠二级结构(淀粉样蛋白纤维和β-淀粉样蛋白孔结构)时导致线粒体细胞膜损伤，产生高细胞毒性，下调宿主免疫力，最终导致死亡。最近报道PB1-F2通过Tom40通道转移到线粒体内膜中，在细胞器内积累，并能损害细胞先天免疫，并发现PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1‑F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒pInHAPB1，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆；以含有血凝素的质粒pCI‑H5HA(哈尔滨兽医研究所陈化兰惠赠，NCBI编号是AF144305)为模板，设计引物进行PCR扩增。在上游引物引入与GFP末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入与PB1‑F2末端16bp的同源臂序列。引物序列如下：P1：GGCATGGATGAACTATACAAATACCATGCAAACAACTCGP2：CACTTCCACCTCCACCGCAAATTCTGCATTGTAACPCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因序列SEQ ID NO.1。1.2高致病性禽流感H5N1病毒PB1‑F2基因的合成：参照已发表的H5N1的PB1‑F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，设计一对扩增PB1‑F2蛋白基因的引物，在上游引物引入与HA 3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG 5’末端16bp的同源臂序列，在下游序列与载体之间引入BamH1酶切位点(下划线为酶切位点)。引物序列如下：P3：GTGGAGGTGGAAGTAGGAGGATGGAACAGGAACAGGP4：GGTACCAAGCTTTTA...

【技术特征摘要】
1.串联表达禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重组枯草芽孢杆菌整合表达质粒pInHAPB1，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆；以含有血凝素的质粒pCI-H5HA(哈尔滨兽医研究所陈化兰惠赠，NCBI编号是AF144305)为模板，设计引物进行PCR扩增。在上游引物引入与GFP末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入与PB1-F2末端16bp的同源臂序列。引物序列如下：P1：GGCATGGATGAACTATACAAATACCATGCAAACAACTCGP2：CACTTCCACCTCCACCGCAAATTCTGCATTGTAACPCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因序列SEQIDNO.1。1.2高致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因的合成：参照已发表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，设计一对扩增PB1-F2蛋白基因的引物，在上游引物引入与HA3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入与枯草芽孢杆菌cotG5’末端16bp的同源臂序列，在下游序列与载体之间引入BamH1酶切位点(下划线为酶切位点)。引物序列如下：P3：GTGGAGGTGGAAGTAGGAGGATGGAACAGGAACAGGP4：GGTACCAAGCTTTTAGGATCCTCCAGTTTATCCACTCTTG参照已发表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陆号：GU596982)，将PB1-F2序列送去南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以P3、P4为引物合成的PB1-F2为模板进行PCR扩增增强肠道DC活性的PB1-F2蛋白。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得低致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因序列SEQIDNO.2。1.3融合HA和PB1-F2片段用重叠PCR将扩增的HA与PB1-F2使用P1，P4引物以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为模板进行PCR扩增获得目的片段HA-PB1-F2。PCR反应反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收获得HA-PB1-F2基因序列SEQIDNO.3。1.4绿色荧光蛋白基因GFP的克隆参照已发表的绿色荧光蛋白基因序列(GenBank登陆号：KU312311.1)设计一对扩增绿色荧光蛋白基因GFP的引物，在上游引物引入与载体基因3’末端16bp的同源臂序列，两序列之间引入Xba1酶切位点(下划线为酶切位点)；在下游引物引入与HA蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：P5：AAGAAATACAAATCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTP6：TCGAGTTGTTTGCATGGTATTTGTATAGTTCATCCATGCC以pINAmyE-CotG-GFPCOE-FimH质粒为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR产物电泳鉴定回收后获得绿色荧光蛋白基因GFP的基因序列SEQIDNO.4。1.5整合表达载体pInHAPB1的构建将回收的SEQIDNO.3序列和SEQIDNO.4序列使用OneStepCloningKit定点克隆试剂盒克隆至载体骨架pInAmyE-CotG(Xba1和BamH1酶切后pINAmyE...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建，黄金凤，曾严，王志胜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32