基于16S rDNA基因种专一序列的临床常见病原菌诊断的生物芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种基于１６Ｓ ｒＤＮＡ基因种专一序列的病原菌诊断的生物芯片。包括固相载体和点载在固相载体上的５００－８００条寡聚核苷酸。所述及的寡聚核苷酸为基于病原菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因种专一序列，包括１３０种呼吸道、消化道及泌尿生殖道临床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因片段。可用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道１３０余种临床常见原菌引起的传染性疾病的诊断。本发明专利技术的基因芯片为一种规模大、集成度高、涵盖面广的临床诊断芯片。具有诊断周期短、操作简单、结果可靠、自动化程度高等优点，易于在临床中推广应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医学临床诊断用的DNA芯片，特别是基于16S rDNA种特异序列的用于临床常见致病细菌的诊断芯片。目前临床上对细菌引起的疾病的诊断，主要依据患者病灶所在的部位、症状，以及对临床标本中的细菌经分离培养后，通过形态、生化、免疫学等方法进行检验分析，最终确诊病原菌的种类。该方法的鉴定周期较长，尤其对于生长缓慢的病原微生物(如结核分枝杆菌(Mycrobacterium tuberculosis))、以及难以培养的病原微生物(如厌氧微生物(anaerobic bacteria))。16S rDNA基因编码细菌16S核糖体RNA，长度约为1600个碱基。由于核糖体的重要生理功能使得16S rDNA序列中有较多的高度保守的片段，通过分析可以找出每种病原菌的种专一序列片段；同时，也容易设计引物对各种细菌的16S rRNA序列进行扩增，在DNA数据库中，16SrDNA序列的所涵盖的物种数量是最多的。1992年Wisotzkey等采用16SrDNA序列分析，对芽孢杆菌属的几种进行了分类研究(Wisotzkey，J.D.，Jurtshuk，P.JR.，Fox，G.E.，et al，1992.Comparative sequence analyses on the16S rRNA(rDNA)of Bacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，andBacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillus gen.nov.Int.J.System.Bacteriol，Vol.42(2)263-269.)该研究以及同类的研究表明，16S rDNA基因用于细菌的定种鉴别是科学和可靠的。依据16S rDNA基因序列进行细菌种类鉴定虽然有准确性高和快速等优点，但是也存在操作步骤多，涉及多种昂贵的仪器设备、难以实现自动化等缺点，尤其是测序这一环节，多数医院无法独立完成，而大量样品的委托测序，由于样品、报告交接等中间环节的增加，使诊断周期以及准确性等受到较大的影响。1997年7月Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.(Encinitas，CA)；Mack；David(Menlo Park，CA)；Chee；Mark S.(Palo Alto，CA)；Bemo；Anthony J.(San Jose，CA)；Stryer；Lubert(Stanford，CA)；Ghandour；Ghassan(Atherton，CA)；Wang；等人公布了US6,228,575号专利，专利技术了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。由于DNA芯片的高度集成性，使其具有灵敏度高、速度快和通量高等优点。因此，如果将生物芯片技术与基因型细菌鉴定技术相结合，可以形成一个准确性高、高灵敏、快速和高通量同时所需的设备条件又大大简化的技术平台，为基因型菌种鉴定技术的实际应用铺平了道路。1994年12月美国AMOCO CORP公司的PELLETIER DALE A；；WEISBURG WILLIAM G等人公布了WO9428174号专利，专利技术了一组核酸探针可以专一的检测军团菌属的病原菌。该专利的核酸探针是根据军团菌(Legionella)的16S和23S核糖体RNA序列设计的。Harmsen等人2002年报导，根据16S rRNA序列设计的17条16-20个碱基的寡聚核苷酸探针，可以分析人体肠道内的六组厌氧微生物，包括Phascolarctobacterium，Veillonella，Eubacterium hallii，Lachnospira，Eubacterium cylindroides，Ruminococcus等(Harmsen，H.J.M.，Raangs，G.C.，He，T.，et al.，2002.Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection ofbacteria in Human feces.Appl.Environ.Microbiol.，Vol.68(6)2982-2990)。以上两个例子充分说明了基于种专一序列的DNA芯片技术用于细菌种的鉴定的可行性及优势。但是，目前应用DNA芯片技术进行细菌种的鉴定的工作仍停留在实验室阶段，一般芯片的规模较小，只能用于检测有限的几种或特定的一类细菌。本专利技术的技术方案本专利技术的芯片包括固相载体和点载在固相载体上的500-800条寡聚核苷酸，构成中低密度DNA微矩阵，优选的固相载体为玻片。所述及的寡聚核苷酸为基于病原菌16S rDNA基因的种专一序列，包括130余种呼吸道、消化道及泌尿生殖道临床常见病原菌以及临床样品中常见的非致病菌16S rDNA基因片段。上述的寡聚核苷酸是通过对所有病原细菌的16S rDNA序列的比对分析而获得的，每种病原菌获得5-10条特有的16-20个碱基的候选短序列，经进一步杂交检验后，最终每种病原菌确定4条特有序列，称为“种专一序列”。所述及的病原菌包括132种常见病原细菌，分别为46种消化道病原细菌，66种呼吸道病原细菌，20种泌尿生殖道病原细菌。所述及的肠道病原细菌(gastrointestinal infectious agents)包括副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi、薛氏沙门氏菌SalmonellaSchottmuelleri、斯坦利沙门氏菌Salmonella Stanley、德尔比沙门氏菌Salmonella Derby、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium、海德尔堡沙门氏菌Salmonella Heidelbeg、猪霍乱沙门氏菌SalmonellaHirschfeldii、猪霍乱沙门氏菌Salmonella Choleraesuis、昆氏沙门氏菌Salmonella kunzondolf、汤普森沙门氏菌Salmonella Thompson、波茨坦沙门氏菌Salmonella Potsdam、纽波特沙门氏菌Salmonella Newport、病牛沙门氏菌Salmonella bovis-morbificans、仙台沙门氏菌Salmonellasandai、伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis、都柏林沙门氏菌Salmonella Dublin、鸡沙门氏菌Salmonellagallinarum、鸭沙门氏菌Salmonella anatum、火鸡沙门氏菌Salmonellameleagridi s、纽因吞沙门氏菌Salmonella Newington、森夫顿堡沙门氏菌Salmonella senftenberg、阿柏丁沙门氏菌Salmonella Aberdeen、痢疾志贺氏菌Shigella dysenteriae、弗氏志贺氏菌Shigella flexneri、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii、索氏志贺氏菌Shigella sonnei、产肠毒素的大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于１６Ｓ ｒＤＮＡ基因种专一序列的病原菌诊断的生物芯片，包括固相载体，其特征在于包括点载在固相载体上的５００－８００条寡聚核苷酸片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马伟，郭晓奎，金维荣，赵国屏，
申请(专利权)人：上海华冠生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]