一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造技术

本发明专利技术涉及基因组改造技术,为一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造。本发明专利技术技术方案涉及能在分枝杆菌中进行精准基因组编辑的质粒构建及其在分枝杆菌中进行连续精准基因敲除的应用。使用本发明专利技术方法进行分枝杆菌基因组编辑的目的DNA片段长度理论上可从bp‑Mb级别且在改造后不在基因组上留下任何疤痕。该方法的建立可为高致病分枝杆菌的致病机理研究和重要甾体激素药物前体生产的重要分枝杆菌工业菌株的基因组改造提供极其重要的基因组编辑手段。

A recombinant plasmid, construction method, and precise genome modification for mycobacteria

The invention relates to genome modification technology, which is a recombinant plasmid, a construction method and an accurate genome modification for mycobacteria. The technical proposal of the invention relates to the construction of plasmids capable of accurate genome editing in mycobacteria and the application of continuous precise gene knockout in mycobacteria. By using the method of DNA fragment length theory of Mycobacterium genome editing on the BP and Mb level from after reconstruction does not leave any scar on the genome. Provide an important means of genome genome editing transformation of the establishment of this method can produce body for the study of pathogenic mechanism of high pathogenic mycobacteria and steroid hormone drugs before the important industrial strain of mycobacterium.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因组改造技术。
技术介绍
20世纪80年代以来，植物甾醇微生物转化生产前体如4AD、9-OH-AD和ADD等已逐渐成为大多数类固醇药物(雄激素，类固醇，雌激素和皮质类固醇)的合成原料。分枝杆菌具有复杂的胆固醇代谢途径，可以代谢植物来源的具有复杂成份的甾醇侧链，经过几十年的诱变育种和基因工程改造，已逐渐成为高效经济地生产此类中间体的主要工业菌株。结核病是困扰全球多年的严重公共健康问题，该病由结核分枝杆菌引起，每年造成约200万人死亡。结核分枝杆菌生长缓慢，可以以胆固醇为唯一碳源生长，对其研究特别是开展基因组操作存在较大的难度。耻垢分枝杆菌mc2155是分枝杆菌特别是结核分枝杆菌使用胆固醇作为唯一碳源和能量源进行生长研究的模式生物，生长快速且无致病性，经过改造后有望成为类固醇合成前体的细胞工厂。Beatriz等(2016)研究表明经过简单的敲除MSMEG_6039(kshB1)和MSMEG_5941(kstD1)，M.smegmatismc2155即可高效地转化植物甾醇生产ADD和4AD等类固醇激素药物合成原料。虽然分枝杆菌的基础研究在疾病治疗和工业生产上均具有重要价值，但由于各种原因(如可能对分枝杆菌的重要性认识较晚)，基于分枝杆菌的操作系统相比放线菌目内的其他属如链霉菌属分子操作手段仍显匮乏。2000年，Tanya等在结核分枝杆菌(M.tubeiculosis)中开发了基于p2NIL和pGOAL质粒的基因打靶系统。该系统由pGOAL质粒提供筛选标记，p2NIL质粒提供多克隆位点以方便克隆重组交换臂及筛选标记。该系统至今仍然是分枝杆菌操作的主要手段。该技术在实际操作过程中仍然相对耗时。如果需要进行基因的插入及精准突变等基因组特定位点的编辑，仍然非常困难且效率不高。同源重组(Homologousrecombination)广泛存在于自然界的生命体中。同源重组的分子过程在生物体内普遍存在，可由DNA双链断裂(DSB)诱导自身蛋白参与的修复。I-sceI是一个染色体的稀有内切酶，亦被称为归巢核酸内切酶，首先发现于酵母线粒体的内含子中。I-sceI识别18bp的非对称序列(attaccctgttatcccta)，在染色体上加入这个序列可以被该酶识别并切割，诱导宿主体内的重组蛋白表达参与DSB的修复，最终导致分子间的重组修复。该系统本质是基于传统的重组臂交换或非同源末端环化等分子机理(NHEJ)以达到敲除基因组上特定DNA片段的技术。DNA在基因组上的敲出、敲入和替换过程传统上均使用交换臂先将带有与染色体对应位置同源的交换臂的目的重组质粒单交换整合至待改造微生物的基因组上，随后使用重组质粒上的抗性基因筛选发生另一个交换臂产生双交换以去除质粒，得到经过改造的突变菌株，敲除臂的长度通常决定了改造效率，交换臂越长，改造效率越高。该方法在实际使用时效率通常较低，难以得到目的DNA改造后的菌株。CRISPR-cas9系统是使用靶向RNA(gRNA)将活性Cas9蛋白引导至基因组上的改造位点，在该位点切割后造成染色体双链断裂(DSB)，引发细胞的重组修复系统来完成特定位点的基因组改造工作，该系统由于同样造成DNA双链断裂(DSB)诱导细胞的重组修复系统参与，通常改造效率较高。与其工作原理相似，只要在目的微生物基因组上通过质粒引入稀有内切酶的酶切位点，相应的稀有内切酶在微生物细胞内经表达形成活性蛋白后，同样可以酶切染色体造成DSB以引发后期的修复改造过程。该系统无需靶向RNA参与，更加方便，适用于基因组较小，染色体上无稀有核酸内切酶酶切位点的微生物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有分枝杆菌基因组改造手段的不足，提供一种通用于分枝杆菌的较为高效快速的基因组编辑质粒及其方法。归巢核酸内切酶是一种稀有核酸内切酶，识别序列较普通二型限制性内切酶长，所以很难在基因组内找到相同的序列。来源：I-sceⅠ基因是有酵母21srRNA基因的ScLSU.1内含子编码的稀有核酸内切酶。识别18bp非对称序列：TAGGGATAACAGGGTAAT。专利技术人在对I-sceI密码子基础上进行优化改造，得到命名为sceM的基因(SEQIDNO:1)，该基因表达酶证明能在耻垢分枝杆菌中有特定位点切割活性。为此，本专利技术需要保护以下各技术方案为：技术方案一所述经过对已有密码子优化改造后的SceM，该酶经本专利技术实验验证可用于分枝杆菌。技术方案二(机理)利用技术方案一中SceM在分枝杆菌中有活性可以进行基因组编辑特性，构建分枝杆菌基因敲除系统。质粒在电转化后将借助同源重组交换臂将该系统中构建的带有同源交换臂的重组质粒整合进入分枝杆菌基因组。当使用ATC作为诱导剂，四环素启动子将起始sceM基因的表达。当诱导表达sceM后，该酶将酶切质粒上插入的唯一的酶切位点，造成染色体在此位置特异性双链断裂(DSB)，引发分枝杆菌特异修复此位点，实现基因或基因组DNA片段的编辑功能。技术方案三pMK101质粒及其构建方法所述由sceM基因构成的pMK101质粒，其特征在于，还包括：一个pBR322的复制起始区；一个氨苄青霉素的抗性基因amp，用于大肠杆菌构建质粒时筛选重组质粒；一个控制所述sceM基因表达的抑制诱导型启动子tetO-tetR(已为现有技术，非本专利技术首次提出)，该启动子在ATC诱导下可开启sceM基因的转录和后续的表达；所述质粒pMK101的基因序列为SEQIDNO:2。所述的pMK101质粒，其特征在于，其构建方法为：步骤1，使用BglⅡ和NheⅠ双酶切pEN4.1A-T10M质粒，得到Pimyc-tetRDNA片段；使用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切pBlueScriptSK(-)质粒，同时加入所述Pimyc-tetRDNA片段连接得到pKS-Pimyc-tetR；步骤2，使用NdeⅠ和KpnⅠ双酶切pLU101质粒,将sceM克隆至pLU101质粒的NdeⅠ和KpnⅠ位点，得到pLU102；随后使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切pLU102，得到923bp的包含PtipA+sceM的DNA片段；使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1获得的所述pKS-Pimyc-tetR质粒，加入所述PtipA+sceM的DNA片段后两者连接得到pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM；步骤3，3.1步骤，使用引物(teto_F：tttaCTGCAGATTGGATCGTCGGCACCGTCA和teto_R：tttacatatgGCGGATCGTGCTCATTTCGG)，以质粒pEN12A-P1为模板，得到Pmyc-tetO启动子，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切，得到Pmyc-tetO启动子DNA片段，备用；3.2步骤，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切步骤2中重组质粒pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM用于去除PtipA启动子，并加入步骤3.1备用的所述Pmyc-tetO启动子DNA片段，最终得到pKS-Pimyc-tetR-Pmyc-sceM，实现构建质粒pMK101。技术方案四精准敲除MSMEG_5228质粒及其构建方法一种pMK5228质粒，包括所述pMK101质粒的元件，其特征在于，还包括：一个来自于pGOAL19质粒的筛选标记；该pG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种命名为sceM的基因，其特征在于，该基因表达酶能在分枝杆菌中有特定位点切割活性，其基因序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种命名为sceM的基因，其特征在于，该基因表达酶能在分枝杆菌中有特定位点切割活性，其基因序列为SEQIDNO:1。2.一种由权利要求1所述sceM基因构建的分枝杆菌基因敲除系统的设计方法，其特征在于，利用sceM基因在分枝杆菌中有活性进行基因组编辑特性，质粒在电转化后将借助同源重组交换臂将该系统中构建的带有同源交换臂的重组质粒整合进入分枝杆菌基因组；使用ATC作为诱导剂，四环素启动子将起始sceM基因的表达；诱导表达sceM后，该酶将酶切质粒上插入的唯一的酶切位点，造成染色体在此位置特异性双链断裂(DSB)，引发分枝杆菌特异修复此位点，实现基因或基因组DNA片段的编辑功能。3.一种由权利要求1所述sceM基因构成的pMK101质粒，其特征在于，还包括：一个pBR322的复制起始区；一个氨苄青霉素的抗性基因amp，用于大肠杆菌构建质粒时筛选重组质粒；一个控制所述sceM基因表达的抑制诱导型启动子tetO-tetR(已为现有技术，非本发明首次提出)，该启动子在ATC诱导下可开启sceM基因的转录和后续的表达；所述质粒pMK101的基因序列为SEQIDNO:2。4.如权利要求3所述的pMK101质粒，其特征在于，其构建方法为：步骤1，使用BglⅡ和NheⅠ双酶切pEN4.1A-T10M质粒，得到Pimyc-tetRDNA片段；使用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切pBlueScriptSK(-)质粒，同时加入所述Pimyc-tetRDNA片段连接得到pKS-Pimyc-tetR；步骤2，使用NdeⅠ和KpnⅠ双酶切pLU101质粒,将sceM克隆至pLU101质粒的NdeⅠ和KpnⅠ位点，得到pLU102；随后使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切pLU102，得到923bp的包含PtipA+sceM的DNA片段；使用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤1获得的所述pKS-Pimyc-tetR质粒，加入所述PtipA+sceM的DNA片段后两者连接得到pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM；步骤3，3.1步骤，使用引物(teto_F：tttaCTGCAGATTGGATCGTCGGCACCGTCA和teto_R：tttacatatgGCGGATCGTGCTCATTTCGG)，以质粒pEN12A-P1为模板，得到Pmyc-tetO启动子，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切，得到Pmyc-tetO启动子DNA片段，备用；3.2步骤，使用PstⅠ和NdeⅠ双酶切步骤2中重组质粒pKS-Pimyc-tetR-PtipA-sceM用于去除PtipA启动子，并加入步骤3.1备用的所述Pmyc-tetO启动子DNA片段，最终得到pKS-Pimyc-tetR-Pmyc-sceM，实现构建质粒pMK101。5.一种pMK5228质粒，包括权利要求3所述pMK101质粒的元件，其特征在于，还包括：一个来自于pGOAL19质粒的筛选标记；该pGOAL19质粒的筛选标记，包括了三个基因：一个潮霉素抗性基因，一个半乳糖苷酶筛选标记lacZ和一个基于蔗糖的反筛选标记sacB；一个来自于链霉菌pIJ773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记apra。6.如权利要求5所述的pMK5228质粒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：路志群，邢述永，杜艳，杨晓章，冯永华，
申请(专利权)人：南通汇成生物科技有限公司，江苏远大仙乐药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32