在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用。本发明专利技术在水稻基因打靶实验过程中，意外获得了一种新的PL‑LbCpf1‑RR基因，发现利用该PL‑LbCpf1‑RR基因进行水稻剪切，能够识别更多基因组位点并且具有高突变效率。此外，并且本发明专利技术提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明专利技术利用所获得的PL‑LbCpf1‑RR构建植物表达载体，构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切，实现了水稻基因打靶，并且获得了高突变效率。

With PL LbCpf1 RR gene mutation and its application in the high efficiency of gene targeting

The present invention provides a PL LbCpf1 RR gene mutation and its application in the high efficiency of gene targeting. The present invention in rice gene targeting in the experimental process, accidentally got a new PL LbCpf1 RR gene, found in rice using the PL shear LbCpf1 RR gene to identify more genomic loci and has high mutation efficiency. In addition, the present invention provides an expression cassette and an expression vector, and the use of the expression cassette and expression vector in gene editing of rice. The plant expression vector was constructed by using the PL LbCpf1 RR, construction of rice rice specific gene targeting vector, resulting in sites of double strand DNA cut into rice cells after the rice gene targeting, and obtain high mutation efficiency.

【技术实现步骤摘要】
在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因及其应用
本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
具体而言，本专利技术涉及一种在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因及其在水稻基因打靶方面的应用。
技术介绍
作物分子育种的关键是高效定向的创制基因突变材料。Cpf1是最近发现的一种位点特异性核酸酶，CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1能够独自地对crRNA前体进行加工，然后利用成熟的crRNA特异性的识别和剪切DNA。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成带有与Cpf1结合和特异识别靶位点的crRNA，同样可以引导Cpf1切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。在水稻，拟南芥，烟草等植物中，通过工程化改造Cpf1，同样可以实现植物基因组特定位点的高效突变。例如，利用工程化的FrancisellanovicidaCpf1可在水稻叶型决定基因Droopingleaf编码区引入靶向突变，造成目标水稻叶片斜披。而利用来源于Lachnospiraceaebacterium菌的Cpf1(LbCpf1)则可高效编辑水稻叶绿素合成相关基因Phytoenedesaturase编码区引入靶向突变，造成目标水稻叶色改变。目前植物中有三种Cpf1，FnCpf1，LbCpf1和来源于Acidaminococcussp.BV3L6的AsCpf1在经工程化改造后可有效作用，而其中效率最高的是LbCpf1。LbCpf1可有效识别基因组中的TTTV(V＝A/C/G)序列作为PAM，从而靶向其下游序列。相对于Cas9识别的NGGPAM，基因组中TTTV的数量明显偏少，造成LbCpf1可编辑数量受限。但是，目前还没有一种通用可行的提高LbCpf1可编辑位点数量并且能够提高LbCpf1基因在作物基因打靶中的突变效率的方法，而且现有的高突变效率的LbCpf1基因数量有限。因此，能够提供更多的在作物基因打靶中提供更多编辑位点的LbCpf1基因是人们迫切希望的，但是这样的基因往往是可遇而不可求的，没有成形的理论或方法能够为人们找到这样的基因提供理论依据。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术希望提供一种在作物基因打靶中具有较多编辑位点并且具有较高突变效率的LbCpf1基因。具体而言，在第一个方面，本专利技术提供一种新的高突变效率PL-LbCpf1-RR基因，命名为PL-LbCpf1-RR，所述PL-LbCpf1-RR基因至少包含如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选地，该基因由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列构成。在第二个方面，本专利技术提供一种含有所述PL-LbCpf1-RR基因的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN600载体并回收，由于合成的PL-LbCpf1-RR序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将PL-LbCpf1-RR连接到pHUN600载体，得到植物表达载体pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN6a11)。另一方面，本专利技术在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。另一方面，本专利技术提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PL-LbCpf1-RR基因。另一方面，本专利技术提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。在另一个方面，本专利技术提供一种利用pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN6a11)表达载体(其含有所述PL-LbCpf1-RR基因)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN6a11-PDS)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带PL-LbCpf1-RR的打靶载体(pHUN6a11-PDS)的农杆菌接触15分钟；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；以及(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。表1培养基的示例性配方表格中所采用的优化的“N6majors”指的是，该N6majors中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。在优选的实施方案中，所述PL-LbCpf1--RR标记基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，具体如：ATGTCCAAGCTGGAGAAGTTTACAAACTGTTACAGCCTCTCCAAAACCCTCAGGTTTAAAGCGATCCCGGTGGGCAAGACCCAGGAGAACATCGACAACAAGAGGCTCCTGGTGGAAGACGAGAAGCGCGCCGAAGACTACAAGGGCGTGAAGAAGCTGCTCGATAGGTACTACCTCAGCTTTATTAACGACGTGCTGCACAGCATCAAACTCAAGAATCTCAACAACTACATCTCCCTCTTCCGCAAAAAGACCCGCACCGAGAAGGAGAACAAGGAGCTGGAGAACCTGGAGATCAACCTCCGCAAGGAAATCGCCAAAGCGTTCAAGGGCAATGAAGGGTACAAGAGCCTCTTCAAGAAAGACATCATCGAAACTATCCTCCCAGAGTTTCTCGATGACAAGGACGAGATCGCGCTGGTGAACTCCTTTAACGGGTTCACAACCGCGTTTACCGGCTTCTTTGATAACAGGGAAAATATGTTCTCCGAGGAGGCCAAGTCCACCAGCATCGCCTTCAGGTGTATCAACGAGAACCTCACCCGCTACATTTCCAATATGGACATTTTCGAGAAGGTGGATGCGATCTTCGATAAGCAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因，其特征在于，所述PL‑LbCpf1‑RR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RR基因至少包含如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RR基因由序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列构成。3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RR基因。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RR基因或权利要求3所述的表达盒。5.一种权利要求1所述的基因、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述PL-LbCpf1-RR基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。6.一种利用含有权利要求1中所述的PL-LbCpf1-RR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；(3)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏程，杨剑波，许蓉芳，李浩，李莉，秦瑞英，李娟，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34