一种水稻核酸酶基因OsGEN‑L的突变基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种水稻核酸酶基因OsGEN‑L的突变体及其应用，属于基因工程技术领域。在本发明专利技术所述的突变体中，核酸酶基因OsGEN‑L突变成osgen‑l，正常的OsGEN‑L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，OsGEN‑L的突变基因osgen‑l的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述突变具体为OsGEN‑L基因的第1053个碱基之后的第1个A碱基缺失，造成翻译提前终止，该突变最终导致突变体的花粉不育，可用于制备隐性雄性核不育系，在水稻的遗传改良、品种选育和种子生产中有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻核酸酶基因OsGEN-L的突变基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及水稻核酸酶基因OsGEN-L及突变基因osgen-l，还涉及OsGEN-L基因的突变体osgen-l，以及核酸酶基因OsGEN-L基因、突变基因osgen-l及突变体osgen-l的应用。
技术介绍
水稻(Oryzasativa)是主要粮食作物之一，全世界约有一半人口以稻米为主食。在我国，水稻播种面积为全国粮食作物播种面积的30％，而总产量却占粮食作物产量的42％以上，其重要原因就是水稻杂种优势的成功应用。细胞核雄性不育是作物杂种优势利用的有效途径之一。但由于核不育很难获得全不育群体，因而限制其在杂种优势中的利用。有效解决母本行中50％可育株问题是核不育利用的关键。在玉米和水稻中已通过花粉致死策略成功解决这一问题，构建了一种核不育的繁殖系统，获得100％的不育群体(Wu等，2015；Chang等，2016)。孢子体核不育基因是这个核不育繁殖系统的必需要素。人们利用各种诱变方法，在水稻中获得新的核不育突变体。比如cyp704b2突变体来源于钴60辐射诱变，这种突变体的花药不产生成熟花粉粒，相关基因已克隆，为CYP704B2基因，编码P450家族蛋白(Li等，2010)。OsGEN-L基因编码RAD2/XPG核酸酶家族的一个成员，用RNAi干涉后造成花粉育性降低或不育，表明该基因参与调控花粉发育(Moritoh等，2005)。由于其干涉后代育性不一致，而且均为显性不育，在育种材料中难以找到恢复系，使得其在杂种优势利用中收到极大限制。获得该基因的隐性突变体对其在品种改良中的应用具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种水稻核酸酶基因OsGEN-L，本专利技术的目的之二在于提供含有所述水稻核酸酶基因OsGEN-L的重组表达载体，本专利技术的目的之三在于提供水稻核酸酶基因OsGEN-L的应用，本专利技术的目的之四在于提供水稻核酸酶基因OsGEN-L的突变基因；本专利技术的目的之五在于提供该突变基因的应用。本专利技术首先对粳稻日本晴成熟干种子的胚进行组培成苗，种植第1代组培苗，分单穗收获，然后种植第二代，在开花期对第二代各株系进行花粉育性观察，筛选不育株，然后用不育株同籼稻中九B进行杂交并种植F1和F2代，再用分子标记进行基因定位；然后对日本晴及突变体的定位区域的候选基因进行测序比对，确定突变位点；然后进行功能验证，最终获得目的基因、突变基因和突变体。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种水稻核酸酶基因OsGEN-L，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，或SEQIDNO.1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个碱基且具有与核酸酶基因OsGEN-L功能相同的基因。2、含有所述水稻核酸酶基因OsGEN-L的重组表达载体。3、所述水稻核酸酶基因OsGEN-L在恢复突变体雄性核不育性状中的应用，所述突变体为水稻核酸酶基因OsGEN-L基因变异产生的雄性核不育性突变体。4、水稻核酸酶基因OsGEN-L的突变基因，所述突变基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。5、所述水稻核酸酶基因OsGEN-L的突变基因在制备雄性核不育的水稻中的应用。所述水稻基因OsGEN-L或其突变基因在水稻育种和制种中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开的水稻核酸酶基因OsGEN-L及其突变基因来源于粳稻日本晴，日本晴的已完成全基因组测序，对下一步的利用有利。文献(Moritoh等，2005)中的不育材料来自于RNAi干涉，其不育表现不彻底，且为显性不育，而本专利技术提供的不育突变体为隐性不育，任何育性正常的材料与之杂交，均可恢复其育性，其实用性强于干涉产生的不育材料。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为本专利技术OsGEN-L突变体和正常的日本晴的植株和花粉形态学观察图。图2为本专利技术OsGEN-L基因定位示意图。图3为本专利技术OsGEN-L互补植株的花药形态和花粉碘染图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本实施例的水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关多肽时，可以将该蛋白的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成调控水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关蛋白的表达载体。相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库，或基因组DNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。实施例1、OsGEN-L突变体植株的获得和形态学的观察2011年冬到2012年春用日本晴干种子的胚诱导愈伤并分化成苗，经生根和锻炼后将组培一代苗移到水田栽种，成熟时分单穗收获，2013年种植第二代，在开花期对第二代各株系进行花粉育性观察，发现一个株系里有5株不育突变株出现，所有不育株的花药无花粉，成熟时不自交结实，但用正常花粉授粉后结实正常(图1)。用突变体同育性正常的日本晴和中九B(籼稻)进行杂交并于2014年种植F1，发现F1全部可育，2015年种植F2代，统计可育和不育的分离比例，结果表明的该不育性受隐性单基因控制。根据后面目的基因的确定和验证，与该不育性相关的基因的正常基因为一RAD2/XPG核酸酶基因OsGEN-L(Moritoh等，2005)，因此将该不育基因命名为osgen-l，其对应的正常基因名称沿用OsGEN-L。实施例2、OsGEN-L基因的定位和克隆一、定位群体用上面的不育突变体同中九B的F2代为定位群体，在田间根据育性进行单株表型鉴定，分单株取15株可育株的幼嫩叶片备用，分单株取F2中所有雄性不育植株的幼嫩叶片备用。二、提取水稻DNA亲本采用改进的CTAB法进行提取，包括如下步骤：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2m1离心管，加入700μL100℃预热的1.5×CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，13000rpm离心10分钟，取上清于新管中，加入900μL无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm离心10分钟。去掉上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻核酸酶基因OsGEN‑L，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个碱基且具有与核酸酶基因OsGEN‑L功能相同的基因。

【技术特征摘要】
1.一种水稻核酸酶基因OsGEN-L，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，或SEQIDNO.1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个碱基且具有与核酸酶基因OsGEN-L功能相同的基因。2.含有权利要求1所述水稻核酸酶基因OsGEN-L的重组表达载体。3.权利要求1所述水稻核酸酶基因OsGEN-L在恢复突变体雄性核不育性状中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，杨昆，吕俊，石敏，陈云，鲜小华，梁艳玲，杜双林，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50