用于治疗威尔森病的核酸构建体和基因治疗载体制造技术

本发明专利技术涉及用于治疗由铜转运ATPase2缺乏或功能障碍引起的病症，尤其是威尔森病的包含ATP7B变体的核酸构建体和基因治疗载体。根据本发明专利技术设计的AAV载体显著降低用该载体处理的威尔森病小鼠中的尿Cu排出和肝Cu含量，同时显著恢复铜蓝蛋白活性。另一方面，施用该载体导致血清转氨酶水平和肝脏组织学正常化，同时明显降低炎症浸润。

Nucleic acid constructs and gene therapy vectors for the treatment of Wilson's disease

The present invention relates to nucleic acid constructs comprising ATP7B variants and gene therapy vectors for the treatment of diseases caused by copper transport, ATPase2 deficiency or dysfunction, especially Wilson's disease. According to the AAV vector design significantly decreased the Cu content in liver and urine discharged by the treatment of Wilson's disease vector Cu mice, while significantly restored the activity of ceruloplasmin. On the other hand, the use of this vector resulted in normalization of serum aminotransferase levels and normalization of liver histology, while significantly reducing inflammatory infiltration.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗威尔森病的核酸构建体和基因治疗载体
本专利技术涉及用于治疗威尔森病和其他病症的核酸构建体和基因治疗载体。
技术介绍
关于威尔森病的基因治疗的技术现状由Merle等(CurrentGeneTherapy2007；7:217-220)综述，在本文中总结并用之后公开的文献完善。威尔森病(WD)是铜代谢的常染色体隐性遗传性，其平均患病率为1：30,000。WD由编码位于13号染色体上的P型铜转运ATPase的ATP7B基因的突变引起。ATP7B主要在肝细胞中表达，并在铜的跨膜转运中起作用。ATP7B蛋白的缺乏或功能降低导致肝细胞排入胆汁中的铜减少，并导致铜主要在肝脏中积聚，随后在神经系统和其他组织中积聚。失去功能性ATP7B蛋白的另一个后果是无法将铜整合入铜蓝蛋白。WD临床上可以呈现为肝病、进行性神经疾病或精神病。肝WD患者通常在儿童期或青春期后期呈现，表现出急性肝炎、暴发性肝衰竭或进行性慢性肝病的特征。WD的神经病学表现通常晚于肝病，最常见于第二十年或第三十年，包括与锥体外系、小脑和脑相关的症状。WD药物治疗的目的是除去体内的有毒铜沉积，并预防其再积聚。目前已经批准了用于WD的三种抗铜药：D-青霉胺、三文胺和锌盐。药物疗法在大多数但不是所有WD患者中有效。肝移植是出现暴发性肝衰竭或进行性肝衰竭的WD患者的一个治疗选择。已经表明它可以纠正WD表型，并提供优异的长期生存期。然而，治疗中断或治疗不足可能导致几个月内死亡。由于WD药物必须定期服用，因此一些患者，特别是青少年WD患者的治疗依从性较差。在治疗过程中，残留神经症状相对较常见，甚至可能发生进行性症状。因为目前的药物治疗选择并不是对所有WD患者都有效且治疗依从性是一个问题，更全面的解决方案可能涉及基因治疗。理论上，在肝细胞中表达野生型ATP7B将逆转所有疾病相关的异常，并拯救肝脏和神经症状。WD的理想基因治疗的最终目标是在终身持续的时间内将足够量的ATP7B特异性递送至肝细胞。所有公开的关于WD的腺病毒基因转移的研究均使用仅产生瞬时转基因表达的早代腺病毒载体。Terada等[Terada等J.Biol.Chem.1998；273:1815-1820；Terada等FEBSLett.1999；448:53-56]通过在LEC大鼠模型中腺病毒介导的基因递送证明了成功的基因转移。显示恢复了全血铜蓝蛋白合成、血清铜蓝蛋白氧化酶活性和铜排入胆汁中，表明了基因转移的治疗效果。这些效果的持续时间非常有限，在第三天水平最高，此后下降。Ha-Hao等[Z.Gastroenterol.2002；40:209-216]也证明了腺病毒介导的ATP7B基因转移后，LEC大鼠的粪便中铜含量增加，表明排入胆汁中的铜增加。全血铜蓝蛋白及其铁氧化酶活性的恢复也证明了治疗效果。然而，再一次，这些实验中的治疗效果的持续时间仅仅是瞬时的，有限的持续几天。目前为止还没有测试用于该应用的无肠腺病毒载体。迄今为止，其他常用的非整合病毒载体系统腺相关病毒(AAV)也没有测试用于WD，主要是因为在AAV载体内(其包装能力为4.4-4.7kb)ATP7B基因(约4.4kb大)留下用于分配其余所需序列(例如启动子、聚A信号序列等)的空间最小。德国专利申请DE100156121A1(公开于2003)提出了一种用于WD基因治疗的重组腺相关病毒载体，其具有缩短的金属敏感启动子(金属硫蛋白-I启动子)以产生铜或锌可诱导的ATP7B转基因表达。然而，该文献没有提供，之后也没有公开关于该载体的疗效和性能的任何信息。另一方面，已经在WD的动物模型中测试了几种携带野生型ATP7B的慢病毒载体。Merle等[Scan.J.Gastroenterol.2006；41:974-982]报道了具有慢病毒载体的LEC大鼠中的系统性基因治疗，所述慢病毒载体在磷酸甘油激酶启动子控制下表达ATP7B。与未处理对照相比，基因转移24周后，经处理大鼠中的肝脏铜含量显著降低且肝组织学改善，但效果仅仅是部分的。与对照相比，基因转移2周后，血清铜蓝蛋白氧化酶活性增加，但在处理后24周降低至较低水平。最近，Roybal等[GeneTherapy2012；19:1085-1094]报告了在肝特异性启动子的转录控制下携带人ATP7B的慢病毒在ATP7B-/-小鼠中的早期妊娠基因转移，其含有载脂蛋白E和α-1抗胰蛋白酶元件。子宫内施用该载体提供肝铜水平的降低、正常肝脏组织学的保留、铜整合入铜蓝蛋白中的恢复以及胆固醇生物合成的改善。然而，治疗的功效在不同小鼠间是非常可变的，随着时间而下降，且从未完全纠正不同病理改变的参数。专利技术简述专利技术人已经工程化并测试了几种携带编码不同截短形式的酶ATP7B的转基因的病毒载体：例如编码ATP7B(d223-366)[ATP7B-T1]的载体AAV2/8AAT-ATP7B(d223-366)；和编码ATP7B(d57-486)[ATP7B-T2]的载体AAV2/8AAT-ATP7B(d57-486)。当向ATP7B敲除小鼠(一种威尔森病的公认动物模型)施用时，在处理至少24周后，携带ATP7B-T2的AAV载体纠正了威尔森病的主要病理特征，而携带ATP7B-T1的AAV载体仅具有部分效果。在用AAV2/8AAT-ATP7B(d57-486)载体处理的威尔森病小鼠中，Cu排出(Cu尿含量)和肝Cu含量显著降低，且铜蓝蛋白活性显著恢复。另一方面，施用载体导致血清转氨酶水平和肝组织学正常化，同时炎性浸润、胆管增生和纤维化明显降低。此外，已经表明对于获得血清铜蓝蛋白活性的正常化和肝脏中Cu积聚的降低两者，每只小鼠1x1010vgAAV2/8-AAT-wtATP7B载体的剂量是wt构建体的“次优剂量”(图10A和11A)；且已经表明所述次优剂量的携带截短形式的载体提供统计学显著的治疗效果(vs未处理)(图10B和11B)。并且，还表明对于这两种治疗效果而言，在剂量为1x1010vg/小鼠的全长ATP7B和T2构建体之间观察到的活性差异是统计学显著的(图12和图14)。这些观察结果表明，编码截短形式的ATP7B(d57-486)的核酸构建体和携带它的载体(尤其是AAV载体)均能够克服与ATP7B缺乏或功能障碍相关的铜积聚的最相关的病理作用，因而非常适于用于以下的基因治疗：由铜转运ATPase2缺乏或功能障碍引起的病症，例如威尔森病，或与ATP7B依赖性溶酶体胞吐作用减少和铜积聚相关的疾病和/或病症。此外，出乎意料地，已经表明一定剂量的截短形式的ATP7B(d57-486)和携带它的载体实现了这些疾病的病理学表现的一些的正常化，而所述剂量的全长ATP7B蛋白和编码该蛋白的载体证明效果较差。因此，本专利技术的第一个方面涉及核酸构建体(以下也称为“本专利技术的核酸构建体”)，其包含：a)真核启动子的核苷酸序列；b)编码截短的铜转运ATPase2(ATP7B)的核苷酸序列，其中N末端重金属相关位点HMA1、HMA2、HMA3和HMA4完全缺失，且HMA5和HMA6保持不缺失；和c)聚腺苷酸化信号序列。在另一个反面，本专利技术涉及包含本专利技术的核酸构建体的表达载体(以下也称为“本专利技术的表达载体”)。在另一个方面，本专利技术涉及包含本专利技术的核酸构建体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸构建体，其包含：a)真核启动子的核苷酸序列；b)编码截短铜转运ATPase2的核苷酸序列，其中N末端重金属相关位点HMA1、HMA2、HMA3和HMA4完全缺失，且HMA5和HMA6保持不缺失；和c)聚腺苷酸化信号序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.17 EP 14382531.31.一种核酸构建体，其包含：a)真核启动子的核苷酸序列；b)编码截短铜转运ATPase2的核苷酸序列，其中N末端重金属相关位点HMA1、HMA2、HMA3和HMA4完全缺失，且HMA5和HMA6保持不缺失；和c)聚腺苷酸化信号序列。2.权利要求1所述的核酸构建体，其中在所述截短ATP7B中的缺失包含SEQIDNO：2序列的氨基酸57-486。3.权利要求1或2所述的核酸构建体，其中截短铜转运ATPase2的氨基酸序列是SEQIDNO：7。4.权利要求3所述的核酸构建体，其中编码所述截短铜转运ATPase2的核苷酸序列选自以下：a)SEQIDNO：6的编码序列CDS，碱基473-3580；b)序列SEQIDNO：8；和c)其中编码截短铜转运ATPase2的至少827个、至少879个、至少931个或至少983个密码子与编码序列SEQIDNO：8的密码子相同的序列。5.权利要求1-4任一项所述的核酸构建体，其中所述真核启动子的核苷酸序列是α1-抗胰蛋白酶基因启动子的核苷酸序列，或包含与白蛋白基因增强子元件组合的α1-抗胰蛋白酶基因启动子序列的嵌合启动子序列。6.权利要求1-5任一项所述的核酸构建体，其中所述真核启动子的核苷酸序列是由SEQIDNO：1(AAT)的碱基156-460或SEQIDNO：5(EalbPa1AT)限定的序列。7.权利要求1-6任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体进一步包含病毒的5’ITR和3’ITR序列。8.权利要求7所述的核酸构建体，其中所述5’ITR和3’ITR序列是腺相关病毒(AAV)。9.权利要求8所述的核酸构建体，其中所述AAV的5’ITR和3’ITR序列是选自以下的血清型：AAV1、AAV2和AAV4，优选是AAV2血清型。10.包含权利要求1-9任一项所述的核酸构建体的表达载体。11.权利要求10所述的表达载体，其中所述载体是AAV载体。12.包含权利要求1-9任一项所述的核酸构建体或权利要求10-11任一项所述的表达载体的宿主细胞。13.包含权利要求1-9任一项所述的核酸构建体或权利要求10-11任一项所述的表达载体的病毒颗粒。14.权利要求13所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV的衣壳蛋白。15.权利要求12所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·穆里罗索卡，G·冈萨雷斯亚瑟古拉扎，R·赫尔南德斯阿尔克瑟巴，
申请(专利权)人：基础应用医学研究基金会，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES