一种神经细胞无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种神经细胞无血清培养基及其应用，神经细胞无血清培养基包括以下成分：基础培养基D‑MEM；生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01‑1μg/ml；蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001‑0.1％；转铁蛋白，终浓度10‑500μg/ml；激素：胰岛素，终浓度：1‑100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1‑10μg/ml；皮质酮，终浓度：1‑100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1‑10μg/ml；其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1‑20μg/ml；丁二胺，终浓度：1‑100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1‑1000μg/ml。与现有技术相比，本发明专利技术为大鼠神经细胞培养提供了更为高效和可靠的无血清培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种神经细胞无血清培养基及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种细胞培养基，尤其是涉及一种神经细胞无血清培养基及其应用。
技术介绍
神经细胞是近代神经学科中研究重点之一，在体外特定环境中，通过培养可以连续地直接观察神经细胞或神经胶质细胞的形态、生长、分化、迁移、突触形成、理化改变以及对环境的反应。实验中常用有血清培养基体外培养原代大鼠的海马神经元细胞和皮层神经细胞进行相关的研究工作。由于神经细胞培养相对困难，存活率低，非神经细胞比例过高，不同细胞培养批次间可重复性差，由此影响了实验结果的可靠性。导致上述神经细胞培养问题的主要原因有动物血清中的一些成分抑制神经细胞的分化和生长、每批次培养液中的成分不一致、实验人员培养细胞的熟练程度等。为了解决这些问题，开发高质量的各种成分确定的无血清培养基势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种神经细胞无血清培养基及其应用，本专利技术提供的神经细胞无血清培养基尤其适用于培养原代大鼠神经元细胞，即作为培养原代大鼠神经元细胞的无血清培养基。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：优化无血清培养基中的各种成分，并将优化后的无血清培养基用于培养大鼠海马神经元细胞和大鼠皮层神经细胞。本专利技术的技术方案具体包括以下内容：技术方案一，提供一种神经细胞无血清培养基，包括以下成分：基础培养基D-MEM；生长因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子(EGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子(VEGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子(BDNF)，终浓度：0.01-1μg/ml；蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1(IGF-1)，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。所述的基础培养基D-MEM为来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065。所述的神经细胞无血清培养基的pH值调节至7.4。技术方案二，提供上述神经细胞无血清培养基的配制方法，每100ml神经细胞无血清培养基配制方法如下，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：取90ml的DMEM培养液，加到一个干净的200ml烧杯中；按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；用0.1N的氢氧化钠调节pH值到7.4；补加DMEM至100ml；用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤到无菌的200ml蓝盖瓶中，于4℃保存备用。技术方案三，提供上述神经细胞无血清培养基的应用，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行神经细胞的培养。每100ml神经细胞有血清培养基通过以下方式配制得到，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：无菌取84mlDMEM培养基；无菌加入10ml胎牛血清，加入5ml马血清，1ml浓度为10mg/ml的谷氨酰胺；保存于4℃环境下备用。所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠海马神经元细胞贴壁培养，具体步骤如下：取15-20天的SD大鼠，用常规方法无菌取出双侧海马，剪碎，置于0.125％(质量分数)的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％(体积分数)CO2，消化20-30分钟；将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液；用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至4～6×105细胞/ml；接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养7天，其间分别换液2次；第7天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。所述大鼠海马神经元细胞生长为典型的海马神经元细胞形态，3周后神经细胞无血清培养基的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠皮层神经细胞贴壁培养，具体步骤如下：取新生的SD大鼠，用常规方法无菌取出脑皮层，剥去脑膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO2，消化20-30分钟；将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液，然后用200目的无菌筛网过滤细胞悬液至另一个离心管中；用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至2～4×105细胞/ml；接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养4天，其间分别换液2次；第4天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。所述大鼠皮层神经细胞生长为典型的皮层神经细胞形态，2周后神经细胞无血清培养基培养的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。尽管有血清培养基能适用于大多数细胞的生长，但是由于血清中复杂的成分，导致其中的某些杂质可能抑制原代细胞，特别是神经细胞的生长。因此本专利技术根据文献报道的一些信息，在基础培养基中补充了一般细胞生长的必要成分如碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、类胰岛素生长因子1、皮质酮、大豆胰蛋白酶抑制剂外，本专利技术根据自己积累的经验，还在该培养基配方中添加了一定比例的脑源性神经营养因子、黄体酮、丁二胺、亚硒酸钠，这些成分充分保证了大鼠神经细胞的良好生长。与现有技术相比，本专利技术为大鼠神经细胞培养提供了更为高效和可靠的无血清培养基。附图说明图1：实施例2中大鼠海马神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养1周的生长状况。图2：实施例3中大鼠海马神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养5天的生长状况。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1一种培养原代大鼠神经元细胞的无血清培养基及其应用，包括以下步骤：一、无血清培养基研制1、基础培养基D-MEM：来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065；2、血清替代物：2.1生长因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子(EGF),终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子(VEG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，包括以下成分：基础培养基D‑MEM；生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01‑1μg/ml；蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001‑0.1％；转铁蛋白，终浓度10‑500μg/ml；激素：胰岛素，终浓度：1‑100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1‑10μg/ml；皮质酮，终浓度：1‑100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1‑10μg/ml；其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1‑20μg/ml；丁二胺，终浓度：1‑100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1‑1000μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，包括以下成分：基础培养基D-MEM；生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01-1μg/ml；蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。2.根据权利要求1所述的一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基D-MEM为来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065。3.根据权利要求1所述的一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基的pH值调节至7.4。4.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的配制方法，其特征在于，每100ml神经细胞无血清培养基配制方法如下，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：取90ml的DMEM培养液；按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；用氢氧化钠调节pH值到7.4；补加DMEM至100ml；用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤，于4℃保存备用。5.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行神经细胞的培养。6.根据权利要求5所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，每100ml神经细胞有血清培养基通过以下方式配制得到，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：无菌取84mlDMEM培养基；无菌加入10ml胎牛血清，加入5ml马血清，1ml浓度为10mg/ml的谷氨酰胺；保存于4℃环境下备用。7.根据权利要求6所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈景才，严中华，
申请(专利权)人：辉源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31