用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型建立方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法，本发明专利技术方法通过病毒感染构建稳定表达β

【技术实现步骤摘要】
用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型建立方法


[0001]本专利技术涉及一种细胞模型的建立方法，尤其涉及用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法。

技术介绍

[0002]人的成纤维细胞生长因子(FGF)包含22个成员，其中FGF19，FGF21和FGF23属于FGF19亚家族，也叫内分泌型FGF。与需要Klotho作为必需辅因子激活FGF信号通路的FGF23不同，FGF19和FGF21需要β
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Klotho辅助因子来增强其与FGF受体(FGFR)的结合能力，进而激活FGF信号通路。FGF19/FGF21与β
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Klotho复合物在体外激活FGFR1c，FGFR2c，和FGFR3c，然而只有FGF19可以激活FGFR4。激活的FGF受体与细胞内信号通路相偶联，主要包括RAS
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MAPK，PI3K
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AKT，PLC,以及STAT通路。FGF19亚家族调控着多种代谢过程，其中FGF19主要抑制肝脏中胆汁酸合成和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有目的基因β
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Klotho和四种慢病毒的转移载体，所述四种慢病毒为FGFR
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FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4；应用慢病毒质粒系统构建病毒表达载体；所述慢病毒质粒系统包括psPAX2慢病毒包装质粒、pMD2.G包膜蛋白质粒、pLVX
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Puro表达载体和pLVX
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IRES
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ZsGreen1表达载体；所述病毒表达载体包括：表达β
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Klotho的pLVX
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Puro
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β
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Klotho表达载体、表达FGFR1c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR1c表达载体、表达FGFR2c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR2c表达载体、表达FGFR3c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR3c表达载体和表达FGFR4的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR4表达载体；所有质粒分别进行高纯度无内毒素抽提；(2)表达β
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Klotho的病毒制备：在15cm培养皿中培养HEK293T细胞达到汇合度为70％左右，根据转染试剂FuGENE的说明书转染60ul FuGENE转染试剂和8ug psPAX2,4ug pMD2.G和8ug pLVX
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Puro
‑
β
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Klotho质粒；24h后更换完全培养基，继续培养24h和48h，分别收集包含病毒颗粒的细胞培养液，将两次收集的含病毒的细胞培养液合并；(3)过表达β
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Klotho的稳定细胞系建立：在6孔板中培养L6大鼠成肌细胞，每孔2
×
105个细胞，贴壁后换成含有8ug/ml polybrene的新鲜培养基并加入适量表达β
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Klotho病毒颗粒的病毒液，侵染24h后换成完全培养基继续培养，侵染后48h换成含10ug/ml puromycin的培养液筛选一周，待未侵染的对照细胞全部被puromycin杀死即可，扩增有puro抗性的细胞，流式细胞仪检测β
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Klotho的表达效率，得到L6
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β
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Klotho细胞系；(4)表达FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4的病毒制备：分别转染8ug psPAX2、4ug pMD2.G和8ug FGFR病毒表达载体于HEK293T细胞中，收集病毒液，具体方法与制备表达β
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Klotho的病毒相同；所述FGFR病毒表达载体为pLVX
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：严中华，刘畅，周瑜，
申请(专利权)人：辉源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：