一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法。利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，通过碳‑14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。与现有技术相比，本发明专利技术方法可用来对化合物库进行高通量筛选，从而得到人源柠檬酸转运蛋白的阳性抑制剂化合物，为下一步的化合物结构改造及药物发现奠定了基础。本发明专利技术可以对大规模的化合物库进行高通量筛选并获得能够抑制柠檬酸转运蛋白作用、具有成为糖尿病等疾病治疗药物的潜力的化合物。

A screening method of citric acid transporter inhibitor

【技术实现步骤摘要】
一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，以及以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型及其应用。
技术介绍
柠檬酸转运蛋白(NaCT)是由哺乳动物Indy基因编码的质膜转运体蛋白，属于溶质转运蛋白家族13(SLC13)的成员。NaCT主要在代谢活跃的组织中表达量较高，其功能为转运三羧酸循环的中间体，并与其中的柠檬酸的亲和力最高。研究表明柠檬酸转运蛋白NaCT表达水平的降低会延长果蝇和线虫寿命，同源蛋白在小鼠体内表达量下降所引起的代谢和生理方面的变化与热量限制的效果十分一致。柠檬酸转运蛋白基因敲除小鼠也表现出葡萄糖代谢和线粒体生物发生的方面的变化，并且保护其免受高热量饮食的影响。这些数据支持了柠檬酸转运蛋白作为代谢调节者的角色，这暗示柠檬酸转运蛋白可以用于治疗饮食和年龄相关性疾病，如II型糖尿病和肥胖症，从而成为在糖尿病及肥胖的药物研发中备受关注的新型靶点。高通量药物筛选是指以分子水平，细胞水平或微组织水平的实验方法为基础，以高密度微孔板(96孔，384孔，1536孔或3456孔)形式作为实验工具载体，在短时间内对数百万的样品进行检测，以半自动化或自动化操作系统执行试验过程，通过快速灵敏的检测仪器对实验结果的数据采集，通过计算机程序软件分析处理大量的实验数据，并通过相应的数据库运营维护来支持整体系运转的技术体系。经典的高通量筛选系统一般包括以下部分：筛选模型，化合物样品库，自动化操作系统，高灵敏度的检测系统和数据库管理系统。分子水平和细胞水平是最常用的筛选模型，通过分子水平和细胞水平的检测可以观察药物与分子靶点的相互作用，从而能够直接认识药物的基本作用机制。其中，基于细胞水平的筛选模型主要使用细胞作为观察对象，观察被筛样品对细胞的作用，通过细胞的不同反应来观察化合物的作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型及其构建方法与应用。本专利技术利用表达人源柠檬酸转运蛋白的稳转细胞系，通过同位素摄取法或基于串联质谱的检测方法构建人源柠檬酸转运蛋白抑制剂的高通量药物筛选模型。本专利技术的筛选模型以人源柠檬酸转运蛋白为靶点，可用于对现有化合物样品库进行筛选，找到具有新颖结构的针对柠檬酸转运蛋白的抑制剂，从而为未来新型的糖尿病及肥胖病药物的发现奠定基础。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系，通过碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。在本专利技术的一个实施方式中，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系所属母细胞系选自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。在本专利技术的一个实施方式中，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系采用以下方法获得：A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5cDNA)的蛋白编码序列(CDS)，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系。在本专利技术的一个实施方式中，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，包括以下步骤：A、在细胞培养瓶或培养皿中传代培养细胞；B、用细胞培养液配制单细胞悬液，以细胞计数仪计数并调整细胞密度为5×105个/毫升至1×106个/毫升；C、转移上述密度的细胞悬液到384孔细胞实验板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000-20000个细胞；D、将上述384孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时，使各孔中的细胞汇合率达到90％-100％；E、弃掉实验板里的细胞培养液，加入20微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育15-30分钟；F、每孔加入20微升含有20微摩尔/升碳-14同位素标记的柠檬酸的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育30-60分钟；G、使用读板仪对上述384孔实验板各孔读数；H、实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异(*表示P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，采用软件GraphPadPrism5计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。在本专利技术的一个实施方式中，基于高通量串联质谱的检测方法，包括以下步骤：A、在细胞培养瓶或培养皿中传代培养细胞；B、用细胞培养液配制单细胞悬液，以细胞计数仪计数并调整细胞密度，按照10000-20000个细胞/孔铺入96孔细胞实验板中；C、将上述96孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时；D、弃掉96孔细胞实验板里的细胞培养液，加入10微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育10-20分钟；E、每孔加入10微升含有10微摩尔/升带有氘原子标记的柠檬酸和10毫摩尔/升氯化锂的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育180-300分钟；F、弃掉96孔细胞实验板里的实验缓冲液，用PBS洗涤4-5次后放入-80摄氏度冰箱，反复融冻5-10次，直至细胞全部脱落；G、向96孔细胞实验板各孔加入150微升90％乙腈，震荡20分钟后以4000转/分钟离心20分钟；将样品按照适当比例稀释后，取100微升在高通量串联质谱仪上检测；H、实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异(*表示P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，采用软件GraphPadPrism计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。在本专利技术的一个实施方式中，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法或基于高通量串联质谱的检测方法中，步骤A中，获得的细胞可以在用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，通过碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，通过碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。


2.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系所属母细胞系选自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。


3.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系采用以下方法获得：
A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5cDNA)的蛋白编码序列，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；
B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；
C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；
D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；
E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系。


4.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，包括以下步骤：
A、传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/毫升至1×106个/毫升；
C、转移上述密度的细胞悬液到细胞实验板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000-20000个细胞；
D、将上述细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时，使各孔中的细胞汇合率达到90％-100％；
E、弃掉实验板里的细胞培养液，加入20微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育15-30分钟；
F、每孔加入20微升含有20微摩尔/升碳-14同位素标记的柠檬酸的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育30-60分钟；
G、使用读板仪对上述实验板各孔读数；
H、实验结果以均数±标准差表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异，采用软件GraphPadPrism5计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。


5.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，基于高通量串联质谱的检测方法，包括以下步骤：
A、传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，调整细胞密度，按照10000-20000个细胞/孔铺入细胞实验板中；
C、将上述细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时；
D、弃掉细胞实验板里的细胞培养液，加入10微升含有所需检测浓度的待测化...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭志刚，徐晶晶，陶敏，王晓辉，刘丽，蓝伟铭，周煜，冯晓雨，金天添，荆为乾，涂成军，潘歆蓓，王洋洋，王震，
申请(专利权)人：辉源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31