本发明专利技术提供了一种丙型肝炎病毒嵌合复制子及其构建方法，丙型肝炎病毒嵌合复制子是丙型肝炎病毒基因型2a和基因型3a与非结构蛋白5b的嵌合复制子，命名为HCV?GT2a/GT3a-NS5b。其构建方法是以pRep-JFH-1为基础，并替换其NS5B的基因为GT3a?NS5B的基因从而得到NS5B嵌合复制子。本发明专利技术丙型肝炎病毒嵌合复制子与现有以GT1b为骨架的嵌合复制子相比，本发明专利技术的嵌合复制子瞬时转染的效率高，不需通过构建稳定细胞株来提高复制子的复制效率，为将来构建更多的HCV临床样品嵌合复制子提供了快速的技术路线。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，特别涉及一种。
技术介绍
流行病学报道显示，全球约有1.7亿人感染了丙型肝炎(HCV)。HCV感染人体后能长期潜伏，并至肝硬化和肝癌。根据不同的基因型，HCV分为la，lb, 2a，2b, 2c, 3a，4a，5a，6a等亚型，其中，基因型I (GTla/lb)占临床感染亚型的74%，基因型2和3占临床感染亚型的22%，基因型4/5/6占临床感染亚型的4%。在中国，临床分离的丙型肝炎主要为基因型1，2，3，其中以基因型GTlb和GT2a为主。人类在与丙型肝炎的斗争中，不断进行探索，研究新的治疗药物及预防性疫苗。但由于该病毒的多变性，导致迄今为止还没有开发出丙型肝炎疫苗。而临床治疗丙型肝炎的药物主要为α-干扰素和利巴韦林，但它们联合用药的效果仅为50%左右。正是由于该病毒的多变性，各制药公司将研发丙型肝炎的药物集中在其相对保守的病毒非结构区(NS区)，如2011年，美国FDA先后批准了 Vertex公司的Telaprevir和Merck公司的Boceprevir，用于治疗丙型肝炎病，这两个药物的靶点均为NS3。目前，还有多个临床试验药物针对的药物靶点为其他非结构蛋白质如NS5a，NS5b。与此同时，科学家们在积极寻找治疗丙型肝炎的广谱药物，即针对各种亚型的药物。丙型肝炎新药开发中的一个重要突破是成功研制出基于GTlb Con-1的复制子，随后亦研制出GTla，GT2a的复制子。但是，针对于GT3/GT4/GT5/GT6的复制子没有开发出来。为了解决GT3/GT4/GT5/GT6复制子的问题，科学家们通过构建GTlb和GT3/GT4/GT5/GT6的NS5a或NS5b的嵌合复制子从而达到研究针对多亚型的广谱药物。但是以GTlb为骨架的嵌合复制子瞬时转染的效率低 ，必须通过构建稳定细胞株来提高复制子的复制效率。为了克服这一问题，我们通过构建GT2a/GT3a-NS5b嵌合复制子，并对其复制效率和对不同药物的敏感性进行了研究。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种易操作、能提高细胞收获率和成活率的。本专利技术的目的是这样实现的:一种丙型肝炎病毒嵌合复制子，是丙型肝炎病毒基因型2a和基因型3a与非结构蛋白5b的嵌合复制子，命名为HCVGT2a/GT3a_NS5b，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。上述丙型肝炎病毒嵌合复制子的构建方法，包括以下步骤:A、首先合成长度为1773bp的DNA片段pNZL5B，该DNA片段为GT3a NZLl株的NS5B基因，其次合成长度660bp的DNA片段pPar-NZL5B-JFH，该片段含有三部分:l_210bp为GT2a JFH-1 NS5A基因的C末端；211_417bp来自GT3a NS5B基因，其中前48个碱基对应GT3a NS5B的前48个碱基，包括NarI酶切位点，后159个碱基对应GT3a NS5B基因C末端的159个碱基，包括终止子和PflMI酶切位点；418-660bp为GT2a JFH-1 3UTR，限制性酶切酶Rsr II和XbaI位点分别位于此660bp的DNA片段两端；B、从pNZL5B酶切Nar I/PflM I片段，并克隆到pPar_NZL5B_JFH中，所得产物PNZL5B-JFH 包含 JFH-1 NS5A 基因的 C 末端 + 全长 GT3a NS5B 基因 +JFH-1 3UTR ；C、酶切 PNZL5B-JFH 中的 Rsr 11/Xba I 片段，并克隆到 p2a_IRES_3UTR 中，得到p2a-1RES-3UTR/NZL5B ；D、从 p2a-1RES-3UTR/NZL5B 中酶切 Pmel/Xbal 片段，并克隆到 pR印-JFH-1 中，从而得到HCV GT2a/GT3a-NS5b嵌合复制子。上述的丙型肝炎病毒嵌合复制子的构建方法，其中，所述p2a-1RES_3UTR为GT2aPJFH-1 复制子合成的中间载体，包含 EMCV IRES 和 JFH-1 N3-NS5B-3UTR, PmeI and XbaI 位点位于N-和C-末端。本专利技术丙型肝炎病毒嵌合复制子与现有以GTlb为骨架的嵌合复制子相比，本嵌合复制子HCV GT2a/GT3a-NS5b瞬时转染的效率高，不需通过构建稳定细胞株来提高复制子的复制效率，为将来构建更多的HCV临床样品嵌合复制子提供了快速的技术路线。附图说明 图1是GT2a复制子的结构示意图。具体实施例方式本专利技术丙型肝炎病毒嵌合复制子的构建是以pRep-JFH-Ι为基础(GT2a复制子，HDB根据文献合成，结构见图1)，并替换其NS5B的基因为GT3a NS5B的基因从而得到NS5B嵌合复制子。具体方 法是:A、首先合成长度为1773bp的DNA片段pNZL5B，该DNA片段为GT3a NZLl株的NS5B基因，其次合成长度660bp的DNA片段pPar-NZL5B-JFH，该片段含有三部分:l_210bp为GT2a JFH-1NS5A基因的C末端；211_417bp来自GT3aNS5B基因，其中前48个碱基对应GT3aNS5B的前48个碱基，包括NarI酶切位点，后159个碱基对应GT3a NS5B基因C末端的159个碱基，包括终止子和PflMI酶切位点；418-660bp为GT2a JFH-1 3UTR，限制性酶切酶RsrII和XbaI位点分别位于此660bp的DNA片段两端。B、从pNZL5B酶切Nar I/PflM I片段，并克隆到pPar_NZL5B_JFH中，所得产物PNZL5B-JFH 包含 JFH-1 NS5A 基因的 C 末端 + 全长 GT3a NS5B 基因 +JFH-1 3UTR。C、酶切PNZL5B-JFH中的Rsr ΙΙ/Xba片段，并克隆到中间载体p2a_IRES_3UTR中(p2a-1RES-3UTR为GT2a pJFH-1复制子合成的中间载体，包含EMCV IRES和JFH-1N3-NS5B-3UTR, PmeI and XbaI 位点位于 N-和 C-末端)，得到 p2a_IRES_3UTR/NZL5B。D、从 p2a-1RES-3UTR/NZL5B 中酶切 Pmel/Xbal 片段，并克隆到 pR印-JFH-1 (GT2a复制子，HDB根据文献合成)中，从而得到HCVGT2a/GT3a-NS5b嵌合复制子。实施例1嵌合复制子的复制动力学比较I)实验方法Huh7 细胞分别用 HCV GTlb/GT3a_NS5b 和 HCV GT2a/GT3a_NS5b 进行瞬时转染，在37°C>5% CO2培养箱中进行培养。转染后的细胞分别于4小时、24小时、48小时、72小时和96小时收集,测试其复制效率。各时间点的Renilla Iuciferase活性按试剂盒说明书进行测试。2)实验结果实验结果如表I所示:表I各时间点相对于4小时时间点的复制率本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒嵌合复制子，是丙型肝炎病毒基因型2a和基因型3a与非结构蛋白5b的嵌合复制子，命名为HCV?GT2a/GT3a?NS5b，其DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种丙型肝炎病毒嵌合复制子，是丙型肝炎病毒基因型2a和基因型3a与非结构蛋白5b的嵌合复制子，命名为HCV GT2a/GT3a-NS5b，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。2.如权利要求1所述丙型肝炎病毒嵌合复制子的构建方法，其特征在于:包括以下步骤: A、首先合成长度为1773bp的DNA片段pNZL5B，该DNA片段为GT3aNZLl株的NS5B基因，其次合成长度660bp的DNA片段pPar-NZL5B-JFH，该片段含有三部分:l_210bp为GT2aJFH-1 NS5A基因的C末端；211-417bp来自GT3a NS5B基因，其中前48个碱基对应GT3aNS5B的前48个碱基，包括NarI酶切位点，后159个碱基对应GT3a NS5B基因C末端的159个碱基，包括终止子和PflMI酶切位点；418-660bp为GT2a JFH-1 3UTR，限制性酶切酶RsrII和XbaI位点分别位于此660b...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈景才，江海清，李忠，张晓霁，张宏达，谈璐瑶，
申请(专利权)人：辉源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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