一种用枯草芽孢杆菌工程菌联合降解植物的木质素的方法技术

本发明专利技术公开了一种用枯草芽孢杆菌工程菌联合降解植物的木质素的方法。属生物技术领域。从微生物中克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因；构建含锰过氧化物酶基因的表达载体、含木质素过氧化物酶基因的表达载体和含漆酶基因的表达载体。分别将以上所述的三种表达载体转化枯草芽孢杆菌，用G418抗性筛选而获得含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。将这三种工程菌与植物原料作用而联合降解植物的木质素。本发明专利技术的优点体现于：这三种枯草芽孢杆菌工程菌对木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的微生物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及构建和应用微生物工程菌的方法。具体是应用微生物工程菌降解植物原料的木质素的方法。
技术介绍
猛过氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、木质素过氧化物酶(LigninPeroxidase, LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者由葡萄糖构成，而后者由戊糖构成。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，形成纤维支架，结构十分稳定。欲利用纤维素则必须先降解木质素。当前用于降解木质素的方法有物理、化学和生物的方法。物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学法主要是酸或碱处理的方法。化学处理法具有工艺简单的特点，但是处理后的纤维素和半纤维素损失大，并 且产生大量的酸碱废气物污染环境。与化学法和物理法相t匕，当前应用的生物法主要是应用天然的表达分泌降解木质素的酶的白腐真菌与植物原料作用而降解植物原料中的木质素。应用白腐真菌降解植物的木质素的优势在于，白腐真菌具有完整的降解木质素的酶系(木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)，其不足之处是白腐真菌所含的锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因只是单拷贝，表达的酶的产量少，并且，白腐真菌生长缓慢，降解木质素的周期长。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是常用于生产重组蛋白的微生物。枯草芽孢杆菌营养要求低，生长能力强，能将表达的蛋白分泌到胞外。
技术实现思路
本专利技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；用含锰过氧化物酶枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用，通过工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木质素。将含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌进行混合应用于降解植物原料的木质素。本专利技术所采用的技术方案是:1.克隆基因:应用反转录PCR或PCR技术从含锰过氧化物酶基因的微生物、含木质素过氧化物酶基因的微生物和含漆酶基因的微生物中分别克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因。2.通过PGR扩增或DNA序列合成获得构建表达载体所需的启动子、信号肽、转录终止子和抗性基因表达框架的DNA序列。3.分别构建含锰过氧化物酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-锰过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的枯草芽孢杆菌表达载体、含木质素过氧化物酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-木质素过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的枯草芽孢杆菌表达载体和含漆酶基因表达框架(巨大芽孢杆菌的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的枯草芽孢杆菌表达载体。以上所构建的表达载体除了含有基因表达框架之外，还有大肠杆菌复制起点、G418基因表达框架和氨苄青霉素基因表达框架。4.通过电转化方法将以上构建的三种枯草芽孢杆菌表达载体分别转化枯草芽孢杆菌。根据G418抗性，筛选高拷贝重组了锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌重组子作为含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；筛选高拷贝重组了含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌重组子作为含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；筛选高拷贝重组了漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌重组子作为含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌。5.将以上构建的含锰 过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌进行混合而作为降解植物的木质素的枯草芽孢杆菌工程菌的混合菌。6.将以上所述的含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的混合菌与植物原料作用，通过工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物的木质素。本专利技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌，并将这三种工程菌进行混合应用，将这种混合菌与植物原料作用，降解植物的木质素的优点体现于:(I)由于工程菌的构建选择了强的启动子调控基因，生产性能好的微生物作为工程菌构建的对象，所以，本专利技术构建的含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的混合菌不仅具备枯草芽孢杆菌本身的营养要求低、生长繁殖迅速等特点，还具备工程菌的良好表达分泌降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)的功能，这三种工程菌的混合应用对植物的木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的表达分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶的天然的微生物。附图说明附图1.枯草芽孢杆菌表达载体I。Pgap.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.MFa因子信号肽；genel.锰过氧化物酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图2.枯草芽孢杆菌表达载体2。Pgap.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.MFa因子信号肽；genel.木质素过氧化物酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图3.枯草芽孢杆菌表达载体3。Pgap.巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.MFa因子信号肽；genel.漆酶基因；TT.转录终止子；G418.G418基因表达框架；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素基因表达框架。附图4.扫描电镜拍的枯草芽孢杆菌工程菌1、枯草芽孢杆菌工程菌2和枯草芽孢杆菌工程菌3与水稻秸杆作用4天后的照片。附图5.扫描电镜拍的含锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶的白腐真菌与水稻秸杆作用4天后的照片。附图6.扫描电镜拍的枯草芽孢杆菌与水稻秸杆作用4天后的照片。附图7.扫描电镜拍的氨水与水稻秸杆作用4天后的照片。附图8.扫描电镜拍的天然的水稻秸杆的照片。具体实施方式 下面采用非限定性实施例对本专利技术作进一步说明。实施例一1.1获得酶基因及构建表达载体所需的相关原件(I)PCR扩增巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。提取巨大芽孢杆菌的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用枯草芽孢杆菌工程菌联合降解植物的木质素的方法，其特征在于：通过分子生物学技术从微生物中克隆锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体、含木质素过氧化酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体和含漆酶基因表达框架的表达载体；分别将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌，并通过G418抗性筛选分别获得表达载体高拷贝重组的含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；将以上所述的三种枯草芽孢杆菌工程菌混合应用，通过表达和分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而联合降解植物的木质素。

【技术特征摘要】
1.一种用枯草芽孢杆菌工程菌联合降解植物的木质素的方法，其特征在于:通过分子生物学技术从微生物中克隆锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因；构建含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体、含木质素过氧化酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体和含漆酶基因表达框架的表达载体；分别将上述构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌，并通过G418抗性筛选分别获得表达载体高拷贝重组的含锰过氧化物酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱联，符仙，杨穗珊，尹慧祥，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：