本发明专利技术涉及涉及野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用。首次从茄子中克隆出CYP77A2基因，命名为StCYP77A2。构建植物表达载体，利用农杆菌介导法将其转入栽培种烟草中，获得转基因烟草植株。采用灌根法，进一步对经过验证的转基因植株的黄萎病的抗性进行分析，结果表明，在接种黄萎病菌后，过量表达StCYP77A2的转基因烟草的发病率和病情指数分别为88.89%和52.78，低于对照的100%和77.78，可以说明该基因对黄萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作为抗性基因资源被应用于茄子等作物的抗黄萎病育种中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
细胞色素P450 (Cytochrome P450,以下简称CYP450)是一类血红素氧化酶系，从简单的细菌到高等动植物普遍存在，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递，参与生物界多种重要的代谢过程。研究表明，其三维结构非常保守，经典的CYP450在催化中心有高度保守的FXXGXRXCXC的结构域。P450应用于植物抗病工程有着巨大潜力，如:1)抑制基因活性:从烟草毛状腺分离的具有羟化酶活性P450(CYP71D16)，在运用反义和共抑制技术鉴定其功能时，发现CYP71D16催化的底物(cembratrieneol)明显增加，使得植株避免了蚜虫的侵染。最近，已获得CYP71D16的启动子，可调控植株产生新的分泌物，提高植物的抗病能力。植株经伤口处理后，CYP74的过量表达则能引起茉莉酸过早过量的积累，说明AOS的过量表达可能是控制高等植物抗病动力学的I种途径。2)引进外源代谢途径:非豆科类的拟南芥植株，经转入异黄酮合酶基因后，能在体内积累5，7，45-三羟基异黄酮(催化生氰糖苷合成的3个酶基因(CYP79A1、CYP71E1和UGT85B)转入拟南芥中，获得的转基因植株在生理表型和适应性上没有发生变，但是，植株能合成新的天然产物(生氰糖苷)，获得对跳甲(Phyllotreta nemorum)的抗性。1994年,Toshihiro Toguri和Kazuhisa Tokugawa从爺子下胚轴组织中克隆得到2个序列相同为71%的CYP450家族基因，但这两个基因的cDNA序列与其他任何CYP450家族基因的同源性均低于30%，因此将这两个基因命名为CYP77A1和CYP77A2的，属于一种新的P450家族。目前，对CYP77家族的研究还很有限，也仅限于少数的几个物种中克隆得到部分全长cDNA或中间片段。CYP77A2目前仅在少数几种植物上被克隆，如栽培种茄子和葡萄。黄萎病(VerticilliumWilt),是由大_轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)侵染引起的爺子重要病害之一。该病原菌分布广，寄主多，如陆地棉、爺子、番爺、马铃薯、甘蓝、油菜、白菜、辣椒等，严重影响了这些作物的产量与品质，造成巨大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种野生茄子细胞色素氧化酶基因 StCYP77A2。本专利技术的另一目的是提供含有该基因的表达载体。本专利技术的有益效果提供该基因及其表达载体的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:StCYP77A2基因，核 苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。所述的StCYP77A2基因编码的蛋白质StCYP77A2，氨基酸序列为SEQ ID N0.2所/Jn ο含有所述的StCYP77A2基因的表达载体。所述的表达载体优选以PCB2008E为出发载体，将所述的StCYP77A2基因插入PCB2008E的Hind III和BamH I酶切位点间所得。所述的StCYP77A2基因在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。所述的StCYP77A2基因的表达载体在构建抗黄萎病转基因烟草中的应用。有益效果:本专利技术以野生爺子托鲁巴姆(Solanum torvum Swartz)为材料，采用同源克隆法扩增StCYP77A2基因。将StCYP77A2基因构建转烟草表达载体，以烟草NC89为供体，进行农杆菌侵染，获得的再生植株经PCR、southern验证，检测出转基因植株。采用灌根法和伤根法进一步对经过验证的转基因植株的黄萎病的抗性进行分析，结果表明，在接种黄萎病菌后，过量表达StCYP77A2的转基因烟草的发病率和病情指数明显低于对照组，可以说明该基因对黄萎病有一定抑制作用。因此，StCYP77A2基因可以作为抗性基因资源被应用于茄子等作物的抗黄萎病育种中。附图说明图1植物表达载体PCB2008E-CYP77A2的构建图2StCYP77 A2转基因烟草植株的PCR检测+:质粒阳性对照；_:未转基因烟草；I 11:转基因烟草图3转CYP77A2基因烟草的southern分析Cl:质粒阳性对照；c2野生型对照；3，5，8，10，11，14:转CYP77A2基因烟草株系图4灌根法检测转CYP77A2基因烟草抗病性A:未处理野生型烟草；8:未处理转0￥卩77八2基因烟草55-14;(::侵染3(1后野生型烟草；D:侵染3d后转CYP77A2基因烟草55-14图5伤根法检测转CYP77A2基因烟草抗病性a, c:未处理野生型烟草；b:未处理CYP77A2基因烟草55_8;d:野生型烟草水对昭.>、、、je:侵染3d后野生型烟草；f:侵染3d后CYP77A2基因烟草55_8。具体实施例方式实施例1野生茄子托鲁巴姆StCYP77A2基因的克隆根据来GenBank中已有的栽培品种茄子CYP77A2基因的mRNA序列进行分析，设计包含完整开放阅读框的引物 CYP77-S: (5，-ATGGATTTTTTCTCAACTTCCT-3，，SEQ ID N0.3)；CYP77-a:(5’-ATTCTTGGTTTAATTTTAGCTCT-3’，SEQ ID N0.4))。以野生茄子幼叶 cDNA 第一链为模板，进行RT-PCR，反应体系为25ul，PCR循环程序如下:94°C 5分钟；94°C 50秒，620C 40秒，72°C 50秒(共35个循环)；72°C 10分钟。测序得到长约1600bp的片段。PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector,转化大肠杆菌DH5ci，PCR检测单克隆，进行测序。用DNAssist软件对测序结果进行分析，StCYP77A2基因ORF为1536bp，起始密码子ATG ;终止密码子TAA，序列如SEQ ID N0.1所示；cDNA编码一个由511个氨基酸残基组成的蛋白，序列如SEQ ID N0.2所示；蛋白分子量为58.08kDa ;理论等电点为9.17。实施例2野生茄子托鲁巴姆StPP5基因过表达载体的构建(图2)将克隆出的基因StCYP77A2的cDNA全长去掉TAA终止密码子，连接到过表达载体 PCB2008E (Zh1-Yong Lei, Ping Zhao et al.(2007)High-throughput BinaryVectors for Plant Gene Function Analysis,Journal of Integrative PlantBiology49 (4):556-567)上的35S启动子后的多克隆位点上，与报告基因GFP蛋白进行融合。将重组载体转化至大肠杆菌DH5ci中，PCR挑取阳性单克隆菌落进行摇菌并提质粒，测序。测序结果表明目的基因已成功插入PBC2008E载体，将重组质粒命名为PCB2008E-StCYP77A2。具体步骤如下: 在StCYP77A2基因(不含TAA)片段的cDNA正反向两端分别加上Hind III和BamH I 酶切位点，正向引物为 77BAMH-S (5，-CCCAAGCTTCTTGGITT本文档来自技高网...
【技术保护点】
StCYP77A2基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.StCYP77A2基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。2.权利要求1所述的StCYP77A2基因编码的蛋白质StCYP77A2，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。3.含有权利要求1所述的StCYP77A2基因的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨清，史策，陈敏，决登伟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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