具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系制造技术

对NK细胞和NK细胞系进行修饰以增加细胞毒性，其中细胞及其组合物用于治疗癌症。产生修饰的NK细胞和NK细胞系是通过基因修饰以除去检查点抑制性受体表达和/或添加突变(变体)TRAIL配体表达。TRAIL配体表达。TRAIL配体表达。

【技术实现步骤摘要】
具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系
[0001]本申请是申请日为2016年7月28日、中国专利申请号为201680049392.8且专利技术名称为“具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系”的中国专利申请的分案申请，并且本申请要求享有EP 15178899.9、GB 1603655.0、GB 1605457.9和GB 1610164.4的优先权。


[0002]本专利技术涉及修饰天然杀伤(NK)细胞和NK细胞系以产生具有更多细胞毒性表型的衍生物。此外，本专利技术涉及生产修饰的NK细胞和NK细胞系的方法、含有所述细胞和细胞系的组合物以及所述组合物在治疗癌症中的用途。

技术介绍

[0003]通常，免疫细胞在触发导致靶细胞死亡的免疫应答之前需要靶细胞经由主要组织相容性复合体(MHC)呈递抗原。这使得不呈递MHC I类的癌细胞能够逃避大部分免疫应答。
[0004]然而，NK细胞能够在不存在MHC I类表达的情况下识别癌细胞。因此，它们在人体对抗癌症的防御中发挥着关键作用。
[0005]另一方面，在某些情况下，癌细胞通过表达结合NK细胞膜上的抑制性受体的配体表现出抑制NK细胞的细胞毒活性的能力。对癌症的抵抗可以涉及这些和其他因素之间的平衡。
[0006]细胞毒性在本文中是指免疫效应细胞(例如，NK细胞)通过例如释放溶细胞的化合物或通过结合癌细胞膜上的受体以及诱导所述癌细胞的凋亡来诱导癌细胞死亡的能力。细胞毒性不仅受到诱导溶细胞化合物的释放的信号的影响，而且受到抑制其释放的信号的影响。因此，如上所述，细胞毒性的增加将导致更有效地杀死癌细胞，癌细胞抑制NK的细胞毒活性的可能性更小。
[0007]作为增加NK细胞对缺乏MHC I类表达但能够抑制NK细胞毒性的癌细胞的细胞毒性的方法，已经提出了去除NK细胞上的抑制性受体功能的基因修饰(Bodduluru et al.2012)。NKG2A已被确定为在这些情况下值得沉默的抑制性受体，因为已知某些癌细胞表达结合NKG2A并在不存在MHC I类表达的情况下抑制NK细胞的细胞毒性的MICA(Shook et al.2011；WO2006/023148)。
[0008]在NK
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92细胞中已经显示了下调NKG2A表达的另一种方法，其中用编码IL
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15的基因转染显示与NKG2A表达的降低相关(Zhang et al.2004)。然而，尽管观察到NK细胞的细胞毒性增加，但该增加可能是活化受体NKG2D的表达伴随增加的结果。这得到NK
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92细胞上阻断NKG2A受体与对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性增加无关的观察结果的支持(Heidenreich et al.2012)。尽管如此，值得注意的是NK
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92细胞系是具有非常低抑制性受体表达的高细胞毒性细胞系。因此，与NKG2A表达降低有关的细胞毒性的任何增加可能太小而无法检测。
[0009]类似的研究已经在小鼠中进行。例如，小鼠在NK细胞上表达称为Ly49的受体，其类
似于人类抑制KIR受体。已经表明，通过用抗体片段阻断Ly49受体，NK细胞具有更强的细胞毒性，并且能够在体外和体内杀死鼠白血病细胞(Koh et al.2001)。
[0010]这是减少抑制性受体功能的结果，然而，体内的“正常”细胞也更容易受到修饰的NK细胞的攻击，因为修饰的NK细胞不能区分“正常”细胞和癌细胞。这是减少“经典”抑制性受体功能的重大缺点。
[0011]已知NK细胞杀死癌细胞的另一种方式是通过在其表面上表达TRAIL。TRAIL配体能够结合癌细胞上的TRAIL受体并诱导所述癌细胞的凋亡。一种推测方法描述了在NK细胞上过度表达TRAIL，以利用这种抗癌机制(EP1621550)。此外，据报道IL
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12上调TRAIL在NK细胞上的表达(Smyth et al.2001)。
[0012]尽管如此，癌细胞已经发展出处理表达TRAIL的NK细胞的回避和保护机制。诱饵TRAIL受体经常在癌细胞膜上表达，并且TRAIL与这些诱饵受体的结合不能诱导凋亡；还没有找到克服这种机制的方法。
[0013]急性骨髓性白血病(AML)是一种造血系统恶性肿瘤，涉及到致力于髓细胞发育的前体细胞，在成人(90％)和儿童(15
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20％)的急性白血病中占相当比例(Hurwitz,Mounce et al.1995；Lowenberg,Downing et al.1999)。尽管80％的患者通过标准化疗获得缓解(Hurwitz,Mounce et al.1995；Ribeiro,Razzouk et al.2005)，但由于微小残留病(MRD)的高复发率，存活率仍不令人满意。五年存活率与年龄有关：儿童(Rubnitz 2012)占60％，65岁以下成年人(Lowenberg,Downing et al.1999)占40％，65岁以上成年人占10％(Ferrara和Schiffer，2013)。如果患者有合适的造血细胞供体，这些结果可以得到改善，但许多人并没有强调需要一种替代的治疗方法。
[0014]天然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，具有不同的表型和与例如天然杀伤T(NK
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T)细胞不同的效应功能。例如，尽管NK
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T细胞表达CD3和T细胞抗原受体(TCR)，但是NK细胞不能。通常发现NK细胞表达标志物CD16和CD56，其中CD16起Fc受体的作用并介导下文讨论的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。KHYG
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1在这方面是一个明显的例外。尽管NK细胞天然具有细胞毒性，但已经开发出具有增强的细胞毒性的NK细胞系。NK
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92和KHYG
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1代表两种NK细胞系，已被广泛研究并在癌症治疗中显示出前景(Swift et al.2011；Swift et al.2012)。
[0015]用于癌症治疗的过继细胞免疫疗法通常涉及向患者施用天然和修饰的T细胞。可以以各种方式修饰T细胞，例如基因修饰，从而表达特异性结合某些靶癌细胞的受体和/或配体。用特异于癌细胞抗原的高亲和性T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)转染T细胞可产生高度反应性的癌症特异性T细胞应答。这种免疫治疗方法的一个主要限制是必须从患者获得T细胞用于自体离体扩增，或者必须使用MHC匹配的T细胞以在细胞转移给患者后，或者在一些情况下移植物抗宿主病(GVHD)发作后立即避免免疫性根除。另外，成功转移的T细胞通常在循环中长时间存活，使得难以控制由治疗引起的持续副作用。
[0016]在单体型移植中，当存在KIR抑制性受体
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配体错配时，认为移植物抗白血病作用是由NK细胞介导的，这可能导致AML治疗的生存率提高(Ruggeri,Capanni et al.2002；Ruggeri,Mancusi et al.2005)。此外，在经历了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人类天然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其被基因修饰以减少一种或多种检查点抑制受体的表达，所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG
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3)、CD279(PD
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1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM
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3。2.根据权利要求1所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9和TIGIT。3.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，其被修饰以减少两种或更多种检查点抑制受体的表达。4.根据权利要求1所述的人类NK细胞或NK细胞系，其被修饰以表达突变TRAIL配体。5.根据权利要求4所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述突变TRAIL配体对TRAIL受体具有增强的亲和力。6.根据权利要求5所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述TRAIL受体为DR4和/或DR5。7.根据权利要求4
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6中任一项所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述突变TRAIL配体对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力。8.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，还表达嵌合抗原受体(CAR)。9.根据权利要求8所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR为双特异性CAR。10.根据权利要求9所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR在一种细胞类型上结合两种配体。11.根据权利要求9所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：昂克医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：