神经组织的制备方法技术

本发明专利技术提供神经细胞或神经组织的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)‑(3)：(1)第一步，用于在不存在饲养细胞的条件下在包括下述各项的培养基中培养多能干细胞：1)TGFβ家族信号转导途径抑制剂和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活剂，和2)未分化维持因子；(2)第二步，用于悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和(3)第三步，用于在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的细胞聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】神经组织的制备方法[
]本专利技术涉及用于由多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织的方法。[
技术介绍
]作为由多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织的方法，已经报道了用于制备神经组织的方法，所述方法包括在无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，悬浮培养所述聚集体，酌情在存在分化诱导因子等的条件下在用于分化诱导的培养基中悬浮培养所述聚集体，从而诱导多能干细胞向目的神经细胞的分化(专利文献1和非专利文献1)。例如，已知用于由多能干细胞得到多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2)，和用于获得多层视网膜组织的方法，所述方法包括在含有Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中形成均匀的多能干细胞聚集体，将其在存在基膜制剂的条件下悬浮培养，并且将其在含血清培养基中悬浮培养(非专利文献3和专利文献3)。另外，还已经报道了用于诱导多能干细胞向下丘脑组织分化的方法(专利文献4和非专利文献4)和诱导多能干细胞向神经前体细胞分化的方法(非专利文献5和6)。在存在饲养细胞的条件下并且加入用于维持未分化状态的因子，培养作为这些制备方法的起始材料的多能干细胞，特别是在灵长类多能干细胞的情形中，从而维持未分化状态。近年来，在维持未分化状态的培养中已经取得了一些改进，并且已经报道了在不存在饲养细胞(无饲养细胞)的条件下加入用于维持未分化状态的因子培养灵长类多能干细胞的方法(非专利文献7、8和9)。需要使用通过该方法进行无饲养细胞培养的多能干细胞作为起始材料的制备神经细胞或神经组织的稳定方法。[文献列表][专利文献][专利文献1]WO2009/148170[专利文献2]WO2011/055855[专利文献3]WO2013/077425[专利文献4]WO2013/065763[非专利文献][非专利文献1]CellStemCell，3，519-32(2008)[非专利文献2]Nature，472，51-56(2011)[非专利文献3]CellStemCell，10(6)，771-775(2012)[非专利文献4]Nature，480，57-62(2011)[非专利文献5]NatureBiotechnology，27(3)，275-80(2009)[非专利文献6]ProcNatlAcadSciUSA，110(50)，20284-9(2013)[非专利文献7]NatureMethods，8，424-429(2011)[非专利文献8]ScientificReports，4，3594(2014)[非专利文献9]InVitroCellDevBiolAnim.，46，247-58(2010)[专利技术概述][专利技术要解决的问题]本专利技术要解决的问题是提供一种用于由在不存在饲养细胞的条件下制备或培养以保持未分化状态的多能干细胞制备诸如视网膜组织等的神经组织和神经细胞的方法。[解决问题的方式]本专利技术人已经进行了深入的研究，尝试解决前述问题，并且发现通过在不存在饲养细胞的条件下(在无饲养细胞条件下)在包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质的培养基中培养多能干细胞，然后将所述细胞进行悬浮培养，可以高效地形成具有光滑表面和致密内部并且维持未分化状态的球形细胞聚集体。另外，本专利技术人已经发现，通过使用这种高质量的细胞聚集体，可以高效地诱导诸如视网膜组织等的神经组织和神经细胞，这导致了本专利技术的完成。即，本专利技术涉及下述各项：[1]用于制备神经细胞或神经组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。[2][1]的制备方法，其中，在第二步中，将在第一步中得到的细胞分散，并且将分散的细胞进行悬浮培养。[3][1]或[2]的制备方法，其中所述用于维持未分化状态的因子是FGF信号转导途径激活物质。[4][3]的制备方法，其中所述FGF信号转导途径激活物质是bFGF。[5][1]-[4]中任一项的制备方法，其中，在第二步中，将细胞在包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质的无血清培养基中悬浮培养。[6][1]-[5]中任一项的制备方法，其中，在第三步中，将所述聚集体在存在分化诱导因子的条件下悬浮培养。[7][1]-[6]中任一项的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Nodal/激活蛋白(Activin)信号转导途径抑制物质、TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。[8][1]-[7]中任一项的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。[9][1]-[8]中任一项的制备方法，其中所述Sonichedgehog信号转导途径激活物质是Shh、SAG或Purmorphamine。[10][1]-[9]中任一项的制备方法，其中第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质。[11][10]的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是选自由BMP2、BMP4、BMP7和GDF7组成的组的一种或多种蛋白。[12][10]的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是BMP4。[13][1]-[12]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含视网膜组织。[14][1]-[13]中任一项的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含选自由下述各项组成的组的一种或多种细胞：视网膜祖先细胞，神经视网膜祖先细胞，感光前体细胞，感光细胞，视杆感光细胞，视锥感光细胞，水平细胞，无长突细胞，中间神经元，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，和睫状边缘区细胞。[15][13]或[14]的制备方法，其中在第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质，并且第二步中的所述培养基包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质。[16][15]的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，在第二步中的培养基中的所述Sonichedgehog信号转导途径激活物质具有与10nM-700nM的SAG的Sonichedgehog信号转导活性相对应的浓度，并且所述视网膜组织是人视网膜组织。[17][15]或[16]的制备方法，其中，在第三步中，在第二步开始后第1天与第9天之间向所述培养基中添加所述BMP信号转导途径激活物质。[18][13]或[14]的制备方法，其中，在第三步中，在包含浓度不超过与700nM的SAG的Sonichedgehog信号转导活性相对应的浓度的Sonichedgehog信号转导途径激活物质的培养基中培养所述聚集体。[19][1]-[9]的制备方法，其中第三步中的所述分化诱导因子是TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Wnt信号转导途径抑制物质。[20][19]的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备神经细胞或神经组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)‑(3)：(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.24 JP 2014-2178671.用于制备神经细胞或神经组织的方法，所述方法包括下述步骤(1)-(3)：(1)第一步，在不存在饲养细胞的条件下在含有1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径激活物质和2)用于维持未分化状态的因子的培养基中培养多能干细胞，(2)第二步，悬浮培养第一步中得到的细胞，从而形成细胞聚集体，和(3)第三步，在存在或不存在分化诱导因子的条件下悬浮培养第二步中得到的聚集体，从而得到包括神经细胞或神经组织的聚集体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在第二步中，将在第一步中得到的细胞分散，并且将分散的细胞进行悬浮培养。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述用于维持未分化状态的因子是FGF信号转导途径激活物质。4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述FGF信号转导途径激活物质是bFGF。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其中，在第二步中，将细胞在包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质的无血清培养基中悬浮培养。6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其中，在第三步中，将所述聚集体在存在分化诱导因子的条件下悬浮培养。7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质、TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是Lefty、SB431542、A-83-01或LDN193189。9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其中所述Sonichedgehog信号转导途径激活物质是Shh、SAG或Purmorphamine。10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其中第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质。11.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是选自由BMP2、BMP4、BMP7和GDF7组成的组的一种或多种蛋白。12.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述BMP信号转导途径激活物质是BMP4。13.根据权利要求1-12中任一项所述的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含视网膜组织。14.根据权利要求1-13中任一项所述的制备方法，其中在第三步中得到的聚集体包含选自由下述各项组成的组的一种或多种细胞：视网膜祖先细胞，神经视网膜祖先细胞，感光前体细胞，感光细胞，视杆感光细胞，视锥感光细胞，水平细胞，无长突细胞，中间神经元，神经节细胞，视网膜色素上皮细胞，和睫状边缘区细胞。15.根据权利要求13或14所述的制备方法，其中在第三步中的所述分化诱导因子是BMP信号转导途径激活物质，并且第二步中的所述培养基包含Sonichedgehog信号转导途径激活物质。16.根据权利要求15所述的制备方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，在第二步中的培养基中的所述Sonichedgehog信号转导途径激活物质具有与10nM-700nM的SAG的Sonichedge...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑原笃，山崎优，平峰靖，笹井芳树，高桥政代，
申请(专利权)人：大日本住友制药株式会社，国立研究开发法人理化学研究所，住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP