制备神经干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种更加稳定的神经干细胞的培养方法，通过原代神经干细胞悬浮培养，达到纯化细胞的目的，之后加入血清进行细胞贴壁培养，极大的加强了神经干细胞的活性，提高了神经干细胞的增殖速度。使神经干细胞的培养更加的稳定，更容易建成相应的神经干细胞系，可以收获大量的神经干细胞而不会出现像传统培养方法那样因没有足够的神经干细胞而不能进行相关科研工作的尴尬情况，培养过程中可以更加直观的观察细胞动态，可以做一些悬浮细胞无法进行的鉴定工作，并且本发明专利技术的制备方法更加简单，便于操作。

【技术实现步骤摘要】
制备神经干细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种制备神经干细胞的方法。
技术介绍
神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。根据分化潜能的时序分为：主要存在胚胎时期的神经管上皮细胞、放射状胶质神经元和神经母细胞，其中，放射状胶质神经元主要存在于幼年时期，可以分裂并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞；神经母细胞主要存在于成年动物体中，可以产生神经前体细胞、神经元和各类神经胶质细胞。根据部位主要分两类：神经嵴干细胞和中枢神经干细胞。目前将具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞都统称为神经干细胞。在神经系统疾病的治疗方面，除了传统的药物、手术及康复治疗外，近年来细胞移植治疗神经系统疾病研究得到了广泛开展，主要包括骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞与神经干细胞移植等。2009年，研究者成功的将人胚胎干细胞注射到脊髓损伤的大鼠体内，从而使大鼠恢复了运动能力，但直接注射胚脂干细胞存在形成肿瘤的风险，经过大量实验证明，利用神经干细胞进行细胞移植治疗神经系统疾病是有效且安全的选择，神经干细胞不具有成瘤性，具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能；是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，具有低免疫源性；其组织融合性好，可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活，是最理想的细胞移植材料。因此，业内一直致力于神经干细胞的临床应用研究。神经干细胞可以由胚胎干细胞、诱导多能干细胞和其它干细胞分化而来。胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群和原始的生殖细胞着床前胚胎内细胞团中分离出来的一种全能性的多功能神经干细胞，这种细胞可以在体外进行扩增培养，因此，提供无致瘤性、且能够在体外快速增殖、稳定传代、大量培养神经干细胞成为目前的当务之急。神经干细胞的体外培养一直是一个比较困难的课题，其难点在于两点，一是所需试剂和因子的浓度配比需要摸索，花费了大量的时间和精力才能达到最佳的配方；二是传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的。这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殪缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞。因此这使得相关的科研工作者很难得到大量的神经干细胞来进行相关的研究工作。为解决传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的，这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殖缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备神经干细胞的方法。为达到上述目的，本专利技术制备神经干细胞的方法，包括如下步骤：l、在无菌条件取得脑神经组织放入神经组织保存液中，并在4～12。C的温度条件下密封保存；2、将步骤l中的神经组织从神经组织保存滚中取出，并使用神经组织洗涤液漂洗；3、将步骤2中漂洗后的神经组织切成碎块，并加入2-3倍体积的神经组织分解液，同时放入35～40。C的二氧化碳培养箱中消化分解45～60分钟，每隔3～5分钟取出震荡一次；4、向步骤3中消化分解后的液体中加入继代细胞培养液，均匀混合后，混合液通过200目的细胞筛，收集过滤液，并使过滤液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，其中，继代细胞培养液是神经组织分解液体积的2倍；5、离心后的过滤液去掉上清液，加入原代细胞培养液，使溶液中的细胞浓度为2×105个／毫升，并保持溶液中细胞悬浮培养，培养后即得到PO代神经干细胞。进一步的，利用步骤5中培养得到的PO代神经干细胞继续传代培养的方法包括以下步骤：(1)Pl代神经干细胞的悬浮培养：①继续培养PO代神经干细胞，当PO代神经干细胞聚集成球后，将其在1500转／分钟的条件下离心8分钟；②离心后的培养液去掉上清液，加入继代细胞培养液，并使培养液中的细胞浓度为1×105个／毫升，接种培养后即得到Pl代神经干细胞；(2)P2代神经干细胞的贴壁培养：继续培养Pl代神经干细胞，当Pl代神经干细胞密度达到80%时，将继代细胞培养液倒出，加入细胞洗涤液，震荡洗涤后将细胞洗涤液倒出，重复洗涤2次后，加入细胞消化液，同时放入35～40。C的二氧化碳培养箱中消化30秒后取出，加入继代细胞培养液贴壁传代培养后即得到P2代神经干细胞；(3)P3代神经干细胞的贴壁培养：①继续培养P2代神经干细胞，P2代神经干细胞密度达到80%时，将继代细胞培养液倒出，加入细胞洗涤液，震荡洗涤后将细胞洗涤液倒出，重复洗涤2次后，加入细胞消化液，同时放入35～40。C的二氧化碳培养箱中消化30秒后取出，加入继代细胞培养液并使细胞悬浮，将培养液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，去掉上清液，再次将培养液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，去掉上清液，加入细胞冻存液，使培养液中的细胞浓度为1×l05～3×105个／亳升，并将培养液在-80。C的温度条件下冻存；②取出冻存的P2代神经干细胞培养液，放入至37～42。C水浴锅中快速震荡使其融化，加入继代细胞培养液贴壁培养后即得到P3代神经干细胞。其中，继代细胞培养液为神经干细胞的含血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、50～250ug/ml的胎牛血清、10～20ng/ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成。所述神经组织保存液为含有链霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的RPMI-1640、DMEM、Q-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合的培养基。神经组织洗涤液为含有青霉素50～250ug/ml、链霉素50～250ug/ml的生理盐水、PBS、D-Hanks中的一种。神经组级分解液为含胶原酶I／胶原酶IV1～2mg/ml、脱氧核糖核酸10.1～0.2mg／ml的DMEM、DMEM/F12、MEM、RPMI-1640中的一种或两种以上混合的培养基。细胞洗涤液为PBS/D-Hanks。原代细胞培养液为神经干细胞的无血清生长培养基，该培养基由lOOOml的基础培养基、10～20ng/ml的bFGF、10～20ng/ml的EGF、15～25ug/ml的B27、10～15ug/ml的N2、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸钠混合组成。细胞消化液为含1.5～2.5mg/ml的胰蛋白酶、0.1～0.25mg/ml的EDTA的PBS。细胞冻存液为含DMS050～200mg／ml的神经干细胞胎牛血清生长培养基。本专利技术的优点是：提供了一种更加稳定的细胞培养方法，通过原代神经干细胞悬浮培养，达到纯化细胞的目的，之后加入血清进行细胞贴壁培养，极大的加强了神经干细胞的活性，提高了神经干细胞的增殖速度。使神经干细胞的培养更加的稳定，更容易建成相应的神经干细胞系，可以收获大量的神经干细胞而不会出现像传统培养方法那样因没有足够的神经干细胞而不能进行相关科研工作的尴尬情况，培养过程中可以更加直观的观察细胞动态，可以做一些悬浮细胞无法进行的鉴定工作，并且本专利技术的制备方法更本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备神经干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1、在无菌条件取得神经组织放入神经组织保存液中，并在4～129℃的温度条件下密封保存；2、将步骤 l中的神经组织从神经组织保存液中取出，并使用神经组织洗涤液漂洗；3、将步骤 2中漂洗后的神经组织切成碎块，并加入2‑3倍体积的神经组织分解液，同时放入35～40℃的二氧化碳培养箱中消化分解45～60分钟，每隔3～5分钟取出震荡一次；4、向步骤 3中消化分解后的液体中加入继代细胞培养液，均匀混合后，混合液通过200目的细胞筛，收集过滤液，并使过滤液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，其中，继代细胞培养液是神经组织分解液体积的2倍；5、离心后的过滤液去掉上清液，加入原代细胞培养液，使溶液中的细胞浓度为2×105个／毫升，并保持溶液中细胞悬浮培养，培养后即得到PO代神经干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备神经干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1、在无菌条件取得神经组织放入神经组织保存液中，并在4～129℃的温度条件下密封保存；2、将步骤l中的神经组织从神经组织保存液中取出，并使用神经组织洗涤液漂洗；3、将步骤2中漂洗后的神经组织切成碎块，并加入2-3倍体积的神经组织分解液，同时放入35～40℃的二氧化碳培养箱中消化分解45～60分钟，每隔3～5分钟取出震荡一次；4、向步骤3中消化分解后的液体中加入继代细胞培养液，均匀混合后，混合液通过200目的细胞筛，收集过滤液，并使过滤液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，其中，继代细胞培养液是神经组织分解液体积的2倍；5、离心后的过滤液去掉上清液，加入原代细胞培养液，使溶液中的细胞浓度为2×105个／毫升，并保持溶液中细胞悬浮培养，培养后即得到PO代神经干细胞。2.根据权利要求1所述的制备神经干细胞的方法，其特征在于，利用步骤5中培养得到的PO代神经干细胞继续传代培养的方法包括以下步骤：(1)Pl代神经干细胞的悬浮培养：①继续培养PO代神经干细胞，当PO代神经干细胞聚集成球后，将其在1500转／分钟的条件下离心8分钟；②离心后的培养液去掉上清液，加入继代细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振宇，
申请(专利权)人：温州市鹿城区中津先进科技研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33