一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法。所述抗AFM1免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂；所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的重链为IgG2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为GVTQESALTTSPGGT，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为EVILVESGGGLVKPG，分子量为150KD。本发明专利技术抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体与活化树脂的偶联率为93.4%，抗AFM1单克隆抗体免疫吸附剂对乳中黄曲霉毒素M1的吸附容量为100 ug/mg抗体，该免疫吸附剂可应用于鲜乳加工中在无损鲜乳营养基础上去除黄曲霉毒素M1。

Anti aflatoxin M1 monoclonal antibody and immune adsorbent, immunoaffinity column and preparation method thereof

The invention provides an anti aflatoxin M1 monoclonal antibody, an immune adsorbent and an immunoaffinity column and a preparation method thereof. The anti AFM1 immune adsorbent monoclonal antibodies against aflatoxin M1 comprises a solid phase carrier and the solid carrier coupling, the solid support for the activation of epoxy resin; the heavy chain of monoclonal antibodies against aflatoxin M1 is IgG2 B, lambda light chain type, 15 before the light chain N-terminal amino acid sequence of GVTQESALTTSPGGT, the heavy chain of 15 amino terminal amino acid sequence before EVILVESGGGLVKPG, the molecular weight is 150KD. The coupling of monoclonal antibodies against aflatoxin M1 and activation of the resin was 93.4%, anti AFM1 monoclonal antibody adsorption capacity of aflatoxin M1 in milk was 100 ug/mg antibodies, the immune adsorbent can be applied in the processing of fresh milk in fresh milk nutrition based lossless removing aflatoxin M1.

【技术实现步骤摘要】
一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法
本专利技术涉及一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂及其制备方法，还涉及一种制备该免疫吸附剂的免疫亲和柱的制备方法，属于食品科学

技术介绍
黄曲霉毒素M1（AflatoxinM1,AFM1）主要存在于乳中，因此最初被称为“牛奶毒素”，由deIongh等发现后发表在1964年的Nature杂志上。随着研究的深入发现，AFM1是黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1,AFB1）是在体内经细胞色素P450系列酶的作用下经羟基化所形成的，一般认为AFB1的羟基代谢物是毒素的解毒形式。然而AFM1不能被看作是AFB1的解毒产物，有许多实验研究表明AFM1都具有细胞毒性和致癌性，是目前影响乳制品安全性的重要有害物之一。由于黄曲霉毒素M1（简称AFM1）耐高温而且稳定性强，在乳制品的加工过程中通常无法通过高温杀菌工艺直接去除，因此，目前还没有通过直接技术手段去除乳中AFM1的污染的方法，控制乳中AFM1的措施只有采用严格的法定残留限量标准和精密检测技术来进行，一旦超标就需要将污染AFM1的乳液进行销毁，常造成巨大的经济损失。典型案例就是2011年国家质检总局公布了蒙牛乳业（眉山）有限公司和福建长富乳品有限公司生产的液体奶中含超标AFM1后引起了社会极大的恐慌，同时也对乳业公司造成了巨大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，该抗体具有很高的分泌特异性和亲和力，能够特异性结合乳中AFM1。本专利技术要解决的第二个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备的免疫吸附剂及其制备方法。本专利技术要解决的第三个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备的免疫亲和柱及其制备方法。本专利技术要解决的技术问题是由如下方案实现的：1、一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的重链为IgG2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为GVTQESALTTSPGGT，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为EVILVESGGGLVKPG，分子量为150KD；所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体与黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和BSA的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，亲和常数为5.5×10-10mol/L。所述黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：（1）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的获得该杂交瘤细胞株系是用完全抗原AFM1-BSA免疫小鼠后所得的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合得到，传代30代分泌抗体活性无差别，杂交瘤细胞在无血清培养基中能稳定分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，在CO2培养箱中培养至细胞全部死亡后培养基中抗AFM1的抗体浓度可达0.15mg/mL；（2）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的筛选所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选采用高通量对比ELISA方法，筛选过程包括以下步骤：选择免疫效价超过10-5以上的小鼠脾脏细胞进行追加免疫，3天后取脾细胞与SP2/0细胞按1：1的比例在分子量为1450的50%PEG作用下进行细胞融合，融合细胞利用HAT培养基调整细胞密度后均匀分配到45块96孔板中，在5%的CO2和37℃的培养箱培养10天；10天后在吸取上清液进行阳性孔的筛选，筛选采用在预先准备好的BSA和AFM1-BSA包被板各45块96孔板利用全自动加样器、Transtar-96等设备移液、洗板、加2抗、加显色液、加终止液后用酶标仪测定OD值，依据拖孔数和在AFM1-BSA包被板中的显阳性而在BSA包被板中显隐性的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的各个融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行亚克隆，获得稳定分泌抗AFM1单克隆抗体的细胞株系；（3）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备采用蛋白A/G纯化，包括以下具体步骤：首先以105/ml的初始密度将筛选的杂交瘤细胞在1升旋转瓶中进行培养，培养细胞全部死亡后利用大容量离心机离心收集上清液，经缓冲液1：1稀释后利用蛋白A/G纯化柱纯化，收集洗脱液并利用Amicon搅拌式超滤装置经3万分子量的透析膜浓缩纯化抗体，浓缩抗体经过ND1000型超微量紫外分光光度计定量后获得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体；抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系在申请日之前的文献中公众可以获得：该文献为：《应用HTS-ELISA筛选方法制备抗黄曲霉毒素M1单抗》.微生物学报.ISTICPKU-2010年10期.裴世春、何娜、张立军、陆梅生。公众可以按照上述文献的方法制得；也可以按照本专利技术方法制得。2、一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂及其制备方法：一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂，所述免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂。上述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂的制备方法为：具体包括以下步骤：1）聚合物微球的制备：将聚乙烯吡咯烷酮溶于无水乙醇与去离子水混合液加入到三口瓶中，搅拌成均相体系后，通入氮气排空，并升至所需反应温度70℃；一次性加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，在搅拌和氮气保护下反应24h后终止反应；将聚合产物进行离心沉降，弃去清液，加入无水乙醇重新分散，再沉降，反复多次，再加入去离子水重新分散，沉降，反复多次，而后真空干燥，获得高分子树脂；1）活化树脂：将高分子树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，按照1g/2L加入浓度为2mol/L的NaOH溶液，边搅拌边加环氧氯丙烷，在40~50℃反应24h，抽干后，用丙酮和蒸馏水洗涤树脂，即得到活化树脂；2）偶联：将活化树脂用大于5倍凝胶体积的偶联缓冲液（0.1mol/L，NaHCO3，pH8.4）抽洗5次，迅速转移至含有黄曲霉毒素M1单克隆抗体的偶联缓冲液（0.1mol/L，NaHCO3，pH8.4）中，室温1h或4℃过夜温和搅拌，使黄曲霉毒素M1单克隆抗体与活化树脂充分偶联，静置，收集偶联树脂；3）封闭：将偶联树脂加入平衡缓冲液（0.1mol/L，pH8.0，Tris-HCl），中室温封闭2h；4）洗涤：然后用200mL的醋酸溶液（0.1mol/L，pH4.0）和平衡缓冲液（0.1mol/L，Tris-HCl，pH8.0）先后交替洗涤4～6次，洗涤后用平衡缓冲液（0.1mol/LpH8.0，Tris-HCl）平衡，即制得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂。3.一种装载抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂的免疫亲和柱的制备方法，具体包括以下具体步骤：取柱管，垫好筛板，将权利要求3制备的偶联抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的免疫吸附剂装入柱管中，滴入平衡缓冲液（0.1mol/L，pH8.0，Tris-HCl）使胶面稳定，封住口底。本专利技术的有益效果是：本专利技术所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体是一种具有分泌高特异性和高亲和力的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂；所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的重链为IgG2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为GVTQESALTTSPGGT，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为EVILVESGGGLVKPG，分子量为150KD。

【技术特征摘要】
1.一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂；所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的重链为IgG2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为GVTQESALTTSPGGT，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为EVILVESGGGLVKPG，分子量为150KD。2.一种制备如权利要求1所述的免疫吸附剂的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1）聚合物微球的制备：将聚乙烯吡咯烷酮溶于无水乙醇与去离子水混合液加入到三口瓶中，搅拌成均相体系后，通入氮气排空，并升至所需反应温度70℃；一次性加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，在搅拌和氮气保护下反应24h后终止反应；将聚合产物进行离心沉降，弃去清液，加入无水乙醇重新分散，再沉降，反复多次，再加入去离子水重新分散，沉降，反复多次，而后真空干燥，获得高分子树脂；1）活化树脂：将高分子树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，按照1g/2L加入浓度为2mol/L的NaOH溶液，边搅拌边加环氧氯丙烷，在40~50℃反应24h，抽干后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小舟，裴世春，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23