一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用。本发明专利技术一般地涉及生物医药检测技术领域，具体地说涉及一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其在毕赤酵母表达外源蛋白检测中的应用。所述毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法为将含有空表达载体的毕赤酵母全宿主蛋白溶液按分子量进行抗原分组，分别免疫动物，合并所得抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。利用该方法制备所得抗体覆盖面全、免疫原性强，利用该抗体建立的ELISA检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高。

Preparation method of Pichia pastoris host protein antibody and application thereof

The invention relates to a preparation method of an antibody of Pichia pastoris host protein and an application thereof. The invention generally relates to the technical field of biological medicine detection, in particular to a preparation method of an antibody of a host protein of Pichia pastoris and its application in the detection of exogenous proteins in Pichia pastoris. The preparation method of Pichia pastoris host protein antibody for containing the empty expression vector of Pichia pastoris whole host antigen protein solution were grouped according to molecular weight, were immunized animal, with the prepared antibody, Pichia pastoris host protein antibody. The antibody prepared by the method has the advantages of full coverage and strong immunogenicity, and the ELISA detection method established by the antibody has strong specificity, stable and reliable detection sensitivity and high detection result.

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物医药检测
，具体的说涉及一种宿主蛋白抗体的制备方法及其应用，更具体的说涉及一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其在表达外源蛋白检测中的应用。
技术介绍
自上世纪80年代，由PhillipsPetroleum公司和SalkInstituteBiotechnology/IndustrialAssociates公司联合开发毕赤酵母表达系统以来，已经有超过1000种外源蛋白在该系统中得到了表达。毕赤酵母表达系统经过近三十年的发展，已基本成为非常完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、phytase、albumin、antibody、collagen等多种外源基因，大量的实例已经证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模，目前还有多种该系统表达的治疗性蛋白处于开发之中。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。但是同其他表达系统一样，毕赤酵母在应用中也存在一些问题，如残留宿主蛋白(Hostcellprotein，HCP)问题。HCP是重组蛋白药物的一个主要杂质成分，即使在最严格的纯化工艺和质量控制下进行生产，微量的HCP残留也不可避免。HCP属异源蛋白，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞（传代细胞）分泌的促生长因子等物质。有研究报道，HCP不仅能引起机体的过敏反应还有可能引起机体对蛋白质药物产生抗体，从而严重影响此类药物的有效性与安全性。除了有效地去除残留HCP外，为了严格控制残余HCP水平，还需要建立快速、准确和灵敏的HCP检测方法。目前用于HCP分析的主要技术包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效液相色谱法和免疫印迹法，但是通常基因工程最终产品中HCP含量都在ppm级，而以上的方法的检测灵敏度和准确性明显不够，无法对高纯度的样品进行有效的HCP定量分析。因此，酶联免疫吸附(ELISA)技术由于其高灵敏度和准确性被认为是行业内HCP的黄金标准检测方法。到目前为止，绝大多数通过FDA批准认可的重组蛋白药物残留HCP定量都是通过ELISA进行测定。ELISA方法的核心就是HCP的特异性抗体，一般HCP抗体的制备方法为含空载体的宿主细胞免疫动物，获得的抗血清，分离纯化的多克隆抗体用于ELISA检测中。但是由于HCP作为抗原分子量大小不一，成分复杂，各成分之间免疫原性差异大，而不容易得到合适的HCP抗体。这是因为，常规方法将HCP全部成分免疫动物之后，获得抗体主要结合分子量大或免疫原性强的HCP成分，对于低分子量或免疫原性弱的HCP成分无结合能力。而如果低分子量或免疫原性弱的HCP成分较多的出现在待检生物制品中时，会导致ELISA检测灵敏度大大降低，并且出现由于部分低免疫原性的HCP成分无法检测而造成实际测定值偏低的现象，由此出现的检测误差导致对生物制品纯度的错误评价已导致一些生物药物的研发失败。HCP的特异性抗体的制备是一个备受探讨关注的问题，尤其是对于临床应用剂量很高的重组蛋白药物，如在临床上对于出血性休克，人血白蛋白单次使用剂量往往超过10克，所以其纯度要求非常严格。上述介绍的抗体制备方法无法很好地满足如此高纯度的重组蛋白药物HCP的鉴定，因此有必要对HCP检测方法进行进一步优化，提高HCP特异性抗体的覆盖率、针对性，以满足对基因工程最终产品中HCP进行有效、灵敏、准确的测定。
技术实现思路
针对现有检测技术存在的上述不足，本专利技术提供了一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，该方法制备所得抗体具有免疫原性强、抗原覆盖率全的特点，利用该抗体建立的ELISA检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：将含有空表达载体的毕赤酵母全宿主蛋白溶液按分子量进行抗原分组，分别免疫动物，合并所得抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。作为一种优选方案，所述毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，具体步骤如下：1）转化空表达载体的毕赤酵母进行培养和诱导表达，发酵液过滤收集上清；2）上清经纯化，浓缩除菌，制得无目的蛋白的毕赤酵母全宿主蛋白溶液；3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组；4）抗原组分别免疫动物，合并抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。其中步骤1）所述毕赤酵母空表达载体优选为pPICZα-A，毕赤酵母优选毕赤酵母X33菌株。目前所使用的各种毕赤酵母菌株均来自于原始的Y-11430菌，X33菌株含有野生型的AOX1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的；毕赤酵母表达载体可为pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C、pPIC3.5K、pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等，优选为pPICZα-A。中国专利ZL200510068186.5就是通过将人血白蛋白基因片段插入pPICZα-A的NspⅤ和EcoRⅠ识别位点间得到表达载体，转化X33菌株构建成为表达人血白蛋白的工程菌。其中步骤2）上清纯化步骤与含目的基因的基因工程毕赤酵母上清纯化步骤相同或是纯化步骤的一部分，纯化步骤优选进行阳离子交换层析，层析树脂优选高盐阳离子交换层析介质CST-ⅡFF或MMC。中国专利ZL200510068187.X公开了一种纯化重组人血白蛋白的方法，即将含重组人血白蛋白的发酵液上清依次经过高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析，得到纯化重组人血白蛋白，其高盐阳离子交换层析介质即为CST-ⅡFF。步骤3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组是通过分子筛层析进行的，分子筛层析树脂优选凝胶过滤填料Superdex75。Superdex75对球状蛋白的分级范围为3×103~7×104，使用Superdex75层析柱对全宿主蛋白溶液（质粒pPICZα-A转化毕赤酵母X33菌株中得到的工程菌发酵，经高盐阳离子交换层析介质CST-ⅡFF或MMC纯化制备而得）进行层析，流出液经紫外检测仪检测，分离为8个组分。步骤3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组，优选分为4组，分组范围：1#>250KD；2#250~100KD；3#100~50KD；4#<50KD。步骤4）免疫动物优选兔或羊。本专利技术的另一种目的是提供上述制备方法所得毕赤酵母宿主蛋白抗体的应用，作为活性成分用于制备检测通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品宿主蛋白残留的试剂或试剂盒。进一步的应用为检测通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品宿主蛋白残留的方法为利用抗体特异性的检测方法，优选ELISA，更优选双抗夹心ELISA。进一步的应用为通过毕赤酵母表达系统制备的生物制品优选为重组人血白蛋白。该方法制备所得抗体具有免疫原性强、抗原覆盖率全的特点，利用该抗体建立的ELISA检测方法检测结果特异性强、稳定可靠、检测灵敏度高，从而为毕赤酵母生物制品宿主蛋白残留的检测，特别是为毕赤酵母表达重组人血白蛋白残留宿主蛋白的检测，提供了一种快速有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，其特征在于：含有空表达载体的毕赤酵母全宿主蛋白溶液按分子量进行抗原分组，分别免疫动物，合并所得抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，其特征在于：含有空表达载体的毕赤酵母全宿主蛋白溶液按分子量进行抗原分组，分别免疫动物，合并所得抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。2.一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法，所述制备方法包含以下步骤：1）转化空表达载体的毕赤酵母进行培养和诱导表达，发酵液过滤收集上清；2）上清经纯化，浓缩除菌，制得毕赤酵母全宿主蛋白溶液；3）全宿主蛋白溶液按照分子量进行抗原分组；4）抗原组分别免疫动物，合并抗体，制得毕赤酵母宿主蛋白抗体。3.根据权利要求2所述的制备方法，步骤1）所述毕赤酵母空表达载体优选为pPICZα-A，毕赤酵母优选X33菌株；培养与诱导表达过程与含目的基因的基因工程毕赤酵母培养诱导表达过程相同，目的基因优选人血白蛋白基因。4.根据权利要求3所述的制备方法，步骤2）上清纯化步骤与含目的基因的基因工程毕赤酵母上清纯化步骤相同或是纯化步骤的一部分，纯化步骤优选进行阳离子交换层析，层析树脂优...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志明，赵伟，王雪，段迎霞，贺丞，潘永刚，刘艳玲，段月娇，高健，段宝玲，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13