用于对核酸探测并作图的RNA‑引导的系统技术方案

使用引导RNA和Cas9蛋白提供对靶核酸的检测、探测、作图和定向测序的方法。提供了检测引导RNA/Cas9复合物与靶核酸的结合的方法，其中引导RNA包含可与探针杂交的3’尾序列。提供了检测引导RNA/Cas9复合物与靶核酸结合的方法，其中物理检测该复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对核酸探测并作图的RNA-引导的系统相关申请信息本申请要求于2014年8月19日提交的美国临时专利申请62/039,341号的优先权，其通过引用其全文纳入本文用于所有目的。
技术介绍
细菌和古细菌CRISPR-Cas系统依赖于与Cas蛋白负荷的短引导RNA以引导入侵外来核酸内存在的互补序列的直接降解。参见Deltcheva，E.等，通过反式编码小RNA和宿主因子RNA酶III的CRISPRRNA突变(CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII).Nature471，602-607(2011)；Gasiunas，G，Barrangou，R.，Horvath，P.和Siksnys，V.Cas9-crRNA核蛋白蛋白复合物介导细菌的获得性免疫的特异性DNA切割(Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica109，E2579-2586(2012)；Jinek，M.等，获得性细菌免疫中可编程的双RNA-引导的DNA内切核酸酶(Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity).Science337，816-821(2012)；Sapranauskas，R.等，嗜热链球菌CRISPR/Cas系统提供大肠杆菌中的免疫(TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli).Nucleicacidsresearch39，9275-9282(2011)；和Bhaya，D.，Davison，M.和Barrangou，R.细菌和古细菌中的CRISPR-Cas系统：获得性防御和调节的通用小RNA(CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea：versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation).Annualreviewofgenetics45，273-297(2011)。最近的酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重建证明与正常反式编码tracrRNA融合的crRNA(“CRISPRRNA”)(“反式-作用CRISPRRNA”)足够引导Cas9蛋白序列特异性切割匹配cdRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9招募以及靶DNA降解。参见H.Deveau等，对嗜热链球菌中CRISPR编码的抗性的噬菌体响应(PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus).JournalofBacteriology190，1390(2008年2月)。已知CRISPR/Cas9系统的各种用途。参见WO2014/099744、WO2013176772、US8,697,359和Sternberg等，Nature，第507卷，第62-67页(2014)。专利技术概述本专利技术的方面涉及检测靶核酸序列的方法，包括使靶核酸序列与引导RNA序列接触，所述引导RNA序列具有与靶核酸序列互补的部分和Cas9蛋白，其中引导RNA和Cas9蛋白共定位至靶核酸序列以形成复合物，并且其中检测该复合物从而检测靶核酸序列。根据一个方面，离体，例如，体外进行该方法，如在容器内或在基材上。根据一个方面，引导RNA和Cas9蛋白经制备并分离以用作本专利技术的体外方法中的试剂。本专利技术的方法的方面包括探测，如对核酸，如DNA的分析型探测或制备型探测、检测、标记、作图、和测序。例如，本专利技术涉及探测DNA的方法，如在单分子水平上，用于鉴定存在DNA，探测DNA，用于亲和纯化该DNA、对DNA作图，以沿着DNA标注具体重要区域，或产生测序起始位点。根据本文所述的方法，形成包含引导RNA、DNA结合蛋白如Cas9蛋白、和双链DNA靶序列的复合物。根据某些方面，本专利技术范围内的DNA结合蛋白包括与引导RNA形成复合物的蛋白质，并且引导RNA将复合物引导到双链DNA序列，复合物在该序列处结合至DNA序列。本专利技术的这一方面可被称为RNA和DNA结合蛋白共定位至双链DNA或与双链DNA共定位。通过这种方式，可施用DNA结合蛋白-引导的RNA复合物来在具体靶DNA序列处形成可检测的复合物，从而检测靶DNA序列的存在。根据某些方面，由于存在可检测标记物，可检测复合物。根据某些方面，复合物可直接标记或间接标记。根据某些方面，可检测标记物可存在于引导RNA、Cas9蛋白或复合物上。根据某些方面，引导RNA的共定位因子可能不是DNA-结合蛋白。可使用试剂来用引导RNA在靶核酸序列处共定位。根据某些方面，引导RNA不需要存在可用于本专利技术的某些方面的DNA结合蛋白。可能不存在DNA结合蛋白。例如，引导RNA本身可结合至靶核酸序列，并且引导RNA可具有与之接合的标记物或其他功能部分以将标记物或其他功能部分定位在靶核酸序列处或其附近。根据某些方面，可通过检测没有可检测标记物的复合物的结构来检测复合物。复合物的物理结构被探测，与观察荧光或其他视觉或光谱上可检测的部分相反。根据某些方面，可通过检测没有可检测标记物的复合物的物理化学性质，如静电荷来检测复合物。这类方法包括使用纳米孔检测方法、电子显微术、光学显微术、扫描探针显微术、原子力显微术、悬臂检测方法、石英晶体检测方法、效应晶体管检测方法检测复合物，其全部都是本领域技术人员已知的。本领域技术人员将易于想象其他能够检测基于本专利技术的复合物的结构的方法。根据某些方面，CRISPRCas9系统内容中的术语“引导RNA”是本领域技术人员已知的并且包括部分，如20个核苷酸部分，其与靶核酸互补。设计引导RNA的方法是本领域技术人员众所周知的。本文所述的方法包括使靶核酸序列与多种引导RNA序列互补，这些序列各自具有与靶核酸序列互补的部分。本文所述的方法包括使队中靶核酸序列与多种相应引导RNA序列互补，其各自具有与相应靶核酸序列互补的部分。根据某些方面，本专利技术的引导RNA包括与靶核酸互补的部分和与探针序列或可检测标记物互补或可与之互补或者与之结合的3’-尾部分或序列。根据一个方面，3’尾部分提供了特异性功能。3’尾部分可以是模块或含有多个元件，针对相同或针对多种功能。根据一个方面，3’尾部分可与一个或多个或多重探针序列或可检测标记物互补或者与之结合(例如，通过适体机制)。各探针序列或可检测标记物可用起到不同作用(例如，一种序列的作用可以是结合至CY3标记的寡核苷酸并且第二种序列的作用可以是结合至Cy5标记的寡核苷酸)。例如，尾序列可用于将功能性蛋白定位至靶核酸序列。例如，尾序列可结合被引导RNA取代的靶双链的部分。根据一个方面，探针序列包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对靶核酸序列进行测序的方法，包括使所述靶核酸序列与具有与所述靶核酸序列互补的部分的引导RNA序列和Cas9蛋白接触，其中所述引导RNA和Cas9蛋白共定位至所述靶核酸序列以形成复合物，并且其中所述Cas9蛋白是Cas9切口酶，其在所述靶核酸的链上形成切口，并且其中引物延伸从切口开始以形成生长链，将互补链用作模板，从而对所述靶核酸进行测序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.19 US 62/039,3411.一种对靶核酸序列进行测序的方法，包括使所述靶核酸序列与具有与所述靶核酸序列互补的部分的引导RNA序列和Cas9蛋白接触，其中所述引导RNA和Cas9蛋白共定位至所述靶核酸序列以形成复合物，并且其中所述Cas9蛋白是Cas9切口酶，其在所述靶核酸的链上形成切口，并且其中引物延伸从切口开始以形成生长链，将互补链用作模板，从而对所述靶核酸进行测序。2.如权利要求1所述的方法，其中所述测序包括检测向所述生长链添加单个核苷酸。3.如权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸是荧光标记的。4.如权利要求2所述的方法，其中核苷酸A、C、G、T是差异标记的并且在碱基添加的各循环中在溶液中提供。5.如权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸是可逆终止子并且进行通过合成的逐步测序。6.如权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸在末端磷酸酯处标记并且进行实时测序。7.如权利要求1所述的方法，其中以线性串分析所述靶核酸序列。8.如权利要求1所述的方法，其中以基本拉伸的线性串分析所述靶核酸序列。9.如权利要求1所述的方法，其中从靶核酸线性串上的多个位点开始从切口的测序启动。10.如权利要求1所述的方法，其中平行分析各核酸和多个靶核酸上的多个位点。11.如权利要求1所述的方法，其中对基因组的一个或多个区域进行测序。12.如权利要求1所述的方法，其中在切口后去除gRNA/Cas9复合物。13.如权利要求1所述的方法，其中在细胞中原位分析核酸。14.如权利要求1所述的方法，其中在细胞中原位分析核酸并在分析之前固定所述细胞。15.如权利要求1所述的方法，其中在分析之前去除RNA分子。16.一种检测靶核酸序列的方法，包括使所述靶核酸序列与具有与所述靶核酸序列互补的部分的引导RNA序列和Cas9蛋白接触，其中所述引导RNA和Cas9蛋白共定位至所述靶核酸序列以形成复合物，其中所述引导RNA包含3’尾核酸序列，使可检测探针序列与所述3’尾序列杂交，并且检测所述可检测探针序列，从而检测所述靶核酸序列。17.如权利要求16所述的方法，其中所述3’尾序列可用作引物。18.如权利要求16所述的方法，其中所述3’尾序列包含与靠近gRNA结合位置的序列互补的序列。19.如权利要求16所述的方法，其中所述3’尾序列包含DNAPAINT的停靠点或柄。20.一种检测靶核酸序列的方法，包括使所述靶核酸序列与具有与所述靶核酸序列互补的部分的引导RNA序列和Cas9蛋白接触，其中所述引导RNA和Cas9蛋白共定位至所述靶核酸序列以形成复合物，并且其中以线性串分析所述靶核酸。21.如权利要求20所述的方法，其中在流或在微米或纳米通道中，所述线性串在表面上拉伸。22.如权利要求20所述的方法，其中所述线性串通过下述方法拉伸：一端接合至表面并且第二端经受包括光学或磁性镊的拉力、物理化学接合、在流中悬空。23.如权利要求20所述的方法，其中检测一个或多个复合物沿所述核酸的结合位置。24.如权利要求20所述的方法，其中多个复合物的结合位置使得能够构建单分子图。25.如权利要求20所述的方法，其中所述gRNA靶向重复DNA并且检测一个或多个重复单元的位置。26.如权利要求20所述的方法，其中所述gRNA靶向DNA上的单拷贝序列。27.如权利要求20所述的方法，其中多个gRNA靶向单个基因组基因座。28.如权利要求20所述的方法，其中多个单拷贝基因座被针对各基因座有特异性的gRNA靶向。29.如权利要求20所述的方法，其中结合至一个基因座可与结合至另一个基因座区分。30.如权利要求20所述的方法，其中多个gRNA结合各基因座。31.如权利要求20所述的方法，其中所述线性串是染色质纤维。32.如权利要求20所述的方法，其中所述线性串在染色体内折叠。33.如权利要求20所述的方法，其中所述线性串在染色体内折叠并且所述染色体是中期或有丝分裂染色体。34.一种检测靶核酸序列的方法，包括使所述靶核酸序列与具有与所述靶核酸序列互补的部分的引导RNA序列和Cas9蛋白接触，其中所述引导RNA和Cas9蛋白共定位至所述靶核酸序列以形成复合物，其中所述靶核酸以一定方式穿过或通过纳米孔或纳米间隙以改变性质，其中通过检测改变的性质来检测所述复合物的结合，从而检测所述靶核酸序列。35.如权利要求35所述的方法，其中通过包括离子电流、电子隧道、或光学检测的方法来检测一个或多个复合物沿着所述核酸的结合位置。36.如权利要求35所述的方法，其中引导物中的识别序列较短，并且引导物的剩余部分包含简并或通用碱基，使得沿着所述靶核酸有许多结合位点。37.如权利要求35所述的方法，其中多个复合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·M·丘奇，F·魏格纳尔特，K·U·米尔，
申请(专利权)人：哈佛学院董事及会员团体，
类型：发明
国别省市：美国,US