扩增DNA以维持甲基化状态的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备扩增的甲基化组的方法，所述方法通过延伸片段和用甲基转移酶和甲基源处理延伸的片段，将半甲基化的双链DNA转化成完全甲基化的双链DNA，来制备扩增的甲基化组。

A method of amplifying DNA to maintain methylation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】扩增DNA以维持甲基化状态的方法相关申请数据本申请要求于2017年3月8日提交的第62/468,595号美国临时申请的优先权，并通过引用将其整体纳入本文用于所有目的。政府权益声明本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的5DP1CA186693政府资助下完成。政府对本专利技术享有某些权利。
技术介绍
专利
本专利技术的实施方式一般涉及用于扩增DNA(例如来自单细胞的DNA，或无细胞的DNA)以维持甲基化信息或状态的方法和组合物。
技术介绍
基因组DNA的亚硫酸氢钠转换已经成为DNA甲基化分析的金标准。用亚硫酸氢盐处理DNA将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶，但不影响5-甲基胞嘧啶残基。该方法提供了区分未甲基化和甲基化胞嘧啶的可能，并提供了DNA甲基化状态的单核苷酸解析图。亚硫酸氢盐转换中的主要挑战是与转换同时发生的DNA降解和片段化。完成转换所必须的条件，例如长孵育时间，升高的温度以及高亚硫酸氢盐浓度都可能导致达90％孵育的DNA降解和片段化。降解随着DNA脱嘌呤发生，导致随机链断裂。大量降解带来问题，而且在诸如与有限量的起始DNA或甚至单个细胞水平的DNA退火时，更加严重。直接对单个细胞进行亚硫酸氢盐转换然后进行DNA扩增可实现低覆盖率的单细胞亚硫酸氢盐转换。Guo,H.,等(2013)."Single-cellmethylomelandscapesofmouseembryonicstemcellsandearlyembryosanalyzedusingreducedrepresentationbisulfitesequencing."(采用减少表现亚硫酸氢盐测序分析小鼠胚胎干细胞的单个细胞以及早期胚胎的甲基化组情况)GenomeRes23(12):2126-2135；Smallwood,S.A.,等(2014)."Single-cellgenome-widebisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity."(用于评估表观遗传学异质性的单个细胞基因组范围的亚硫酸氢盐测序)NatMethods11(8):817-820。在细胞间变异和种群异质性起关键作用的研究中，如肿瘤生长、干细胞重编程、记忆形成、胚胎发育等，对单个细胞水平DNA进行高覆盖率基因组甲基化研究的能力非常重要。当进行分析的细胞样品是珍稀的、或罕见的、或少量的，例如当样品是一个细胞或单个细胞的完整或部分基因组，或无细胞DNA时。各种已知的扩增方法，例如全基因组扩增法导致来自原始模板的甲基化信息或状态丧失。这样的全基因组扩增方法包括多重置换扩增(MDA)，其是在测序和其它分析之前在采用来自单个细胞的基因组DNA的领域的常用方法。在该方法中，随机引物退火后，利用具有强链置换活性的DNA聚合酶进行延伸。来自单个细胞的原始基因组DNA以级联样的形式指数扩增，以形成超支化DNA结构。扩增来自单个细胞的基因组DNA的其它方法述于Zong,C.,Lu,S.,Chapman,A.R.,和Xie,X.S.(2012),人单个细胞的单核苷酸和拷贝数变异的基因组范围检测(Genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell),Science338,1622-1626，其中描述了多重退火和基于环型的扩增循环(MALBAC)。本领域所知的另一方法是简并寡核苷酸引发的PCR或DOP-PCR。用于单个细胞基因组DNA的若干其他方法包括：Cheung,V.G.和S.F.Nelson,使用简并寡核苷酸引物的全基因组扩增允许成百上千个基因型以少于一纳克的基因组DNA进行(WholegenomeamplificationusingadegenerateoligonucleotideprimerallowshundredsofgenotypestobeperformedonlessthanonenanogramofgenomicDNA),ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1996.93(25):14676-9页；Telenius,H.,等,简并寡核苷酸引发的PCR：通过单个简并引物的常规扩增(Degenerateoligonucleotide-primedPCR:generalamplificationoftargetDNAbyasingledegenerateprimer),Genomics,1992.13(3):718-25页；Zhang,L.,等,单个细胞的全基因组扩增：对基因分析的启示(Wholegenomeamplificationfromasinglecell:implicationsforgeneticanalysis).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1992,89(13):5847-51页；Lao,K.,N.L.Xu,和N.A.Straus,使用单个引物的PCR的全基因组扩增(Wholegenomeamplificationusingsingle-primerPCR),BiotechnologyJournal,2008,3(3):378-82页；Dean,F.B.,等,使用多重置换扩增的完整人基因组扩增(Comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification),ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2002.99(8):5261-6页；Lage,J.M.,等,使用超支化链置换扩增和列阵-CGH对小DNA样品中基因变异的全基因组分析(WholegenomeanalysisofgeneticalterationsinsmallDNAsamplesusinghyperbranchedstranddisplacementamplificationandarray-CGH),GenomeResearch,2003,13(2):294-307页；Spits,C.,等,单个细胞全基因组置换扩增的优化和评价(Optimizationandevaluationofsingle-cellwhole-genomemultipledisplacementamplification),HumanMutation,2006,27(5):496-503页；Gole,J.,等,使用纳升微管进行单个细胞大规模平行聚合酶克隆和基因组测序(Massivelyparallelpolymerasecloningandgenomesequencingofsinglecellsusingnanoliter本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备扩增的甲基化组的方法，所述方法包括：/n(a)片段化具有甲基化模式的双链DNA序列，以产生片段模板双链DNA序列，其具有甲基化模式且在片段模板双链DNA序列的各5’末端和3’末端具有引物结合位点,/n(b)将片段模板双链DNA序列分成上模板链和下模板链,/n(c)用引物、聚合酶和核苷酸延伸上模板链和下模板链，产生未甲基化的互补链，得到半甲基化的双链DNA序列，其对应于具有甲基化模式的片段模板双链DNA序列,/n(d)用甲基转移酶和甲基源处理半甲基化双链DNA序列以在对应于相应片段化模板双链DNA序列的甲基化胞嘧啶的位置加上甲基，以产生完全甲基化的片段模板双链DNA序列；和/n(e)重复步骤(b)到(d)产生片段模板双链DNA序列的完全甲基化扩增子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170308 US 62/468,5951.一种制备扩增的甲基化组的方法，所述方法包括：
(a)片段化具有甲基化模式的双链DNA序列，以产生片段模板双链DNA序列，其具有甲基化模式且在片段模板双链DNA序列的各5’末端和3’末端具有引物结合位点,
(b)将片段模板双链DNA序列分成上模板链和下模板链,
(c)用引物、聚合酶和核苷酸延伸上模板链和下模板链，产生未甲基化的互补链，得到半甲基化的双链DNA序列，其对应于具有甲基化模式的片段模板双链DNA序列,
(d)用甲基转移酶和甲基源处理半甲基化双链DNA序列以在对应于相应片段化模板双链DNA序列的甲基化胞嘧啶的位置加上甲基，以产生完全甲基化的片段模板双链DNA序列；和
(e)重复步骤(b)到(d)产生片段模板双链DNA序列的完全甲基化扩增子。


2.如权利要求1所述的方法，还包括用将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂处理片段双链DNA序列的全甲基化扩增子，并分析甲基化胞嘧啶模式。


3.如权利要求1所述的方法，步骤(a)中的片段化通过使双链DNA序列与转座体文库接触实现，文库的每一个转座体具有其独特的相关条码序列，其中文库中的各转座体包含转座酶和转座子DNA同二聚体，其中同二聚体的每个转座子DNA包括转座酶结合位点、独特的条码序列和引物结合位点，其中转座体文库与沿着双链DNA序列的目标位置结合，转座酶将双链DNA序列切割成片段模板双链DNA序列，每个片段模板双链DNA序列在片段模板双链DNA序列的每个末端包括独特条码序列对的一个成员，
填充在转座子DNA和片段模板双链DNA序列之间的缺口，形成片段模板双链DNA序列文库，其在每一个末端具有引物结合位点。


4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括镁离子，步骤(d)的处理包括加入螯合剂来螯合镁离子。


5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括镁离子，步骤(d)的处理包括加入EDTA来螯合镁离子。


6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括镁离子，步骤(d)的处理包括加入等摩尔的EDTA来螯合镁离子，产生甲基转移酶的理想缓冲条件。


7.如权利要求1所述的方法，步骤(e)包括在重复的步骤(c)中加入镁离子以产生引物延伸的理想引物延伸缓冲条件。


8.如权利要求1所述的方法，所述甲基转移酶是DNMT1。


9.如权利要求3所述的方法，其中所述转座酶是Tn5转座酶、Mu转座酶、Tn7转座酶或IS5转座酶。


10.如权利要求2所述的方法，其中将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂是亚硫酸氢盐。


11.如权利要求1所述的方法，其中所述双链DNA序列是基因组DNA。


12.如权利要求1所述的方法，其中双链DNA序列是获自单细胞的全基因组DNA或无细胞DNA。


13.如权利要求1所述的方法，其中双链DNA序列是来自产前细胞、癌细胞或循环肿瘤细胞的基因组DNA。


14.如权利要求1所述的方法，其中双链DNA序列是获自个体血样的无细胞肿瘤细胞基因组DNA。


15.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)-(d)重复1-20次。


16.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)-(d)重复1-10次。


17.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)-(d)重复1-5次。


18.如权利要求1所述的方法，其中用将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂处理片段模板双链DNA序列的完全甲基化扩增子。


19.如权利要求2所述的方法，其中将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂是APOBEC家族的酶。


20.如权利要求2所述的方法，其中将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂是APOBEC3A。


21.如权利要求1所述的方法，其中引物是基因座特异性引物。


22.如权利要求1所述的方法，其中引物是疾病特异性引物。


23.如权利要求1所述的方法，其中引物是癌症特异性引物。


24.一种诊断患有癌症的个体的方法，包括：
(a)片段化获自个体液体活检样品的双链DNA序列，其中双链DNA序列具有甲基化模式，以产生片段模板双链DNA序列，其具有甲基化模式且在片段模板双链DNA序列的各5’末端和3’末端具有引物结合位点，
(b)将片段模板双链DNA序列分成上模板链和下模板链,
(c)用癌症特异性引物、聚合酶和核苷酸延伸上模板链和下模板链，产生未甲基化的互补链，得到半甲基化的双链DNA序列，其对应于具有甲基化模式的片段模板双链DNA序列,
(d)用甲基转移酶和甲基源处理半甲基化双链DNA序列以在对应于相应片段化模板双链DNA序列的甲基化胞嘧啶的位置加上甲基，以产生完全甲基化的片段模板双链DNA序列；和
(e)重复步骤(b)到(d)产生片段模板双链DNA序列的完全甲基化扩增子；
用将胞嘧啶残基转换成尿嘧啶的试剂处理片段模板双链DNA序列的完全甲基化扩增子；
确定甲基化胞嘧啶模式；
将甲基化胞嘧啶模式与癌症DNA的标准甲基化胞嘧啶模式比较；
确定甲基化胞嘧啶模式和癌症DNA的标准甲基化胞嘧啶模式之间的差异；和
当确定的甲基化胞嘧啶模式与癌症DNA的标准甲基化胞嘧啶模式匹配时，诊断该个体患有癌症。


25.如权利要求24所述的方法，其中液体活检样品是血样、脊髓液样品或尿样。


26.如权利要求24所述的方法，其中步骤(c)包括镁离子，步骤(d)的处理包括加入螯合剂来螯合镁离子。

【专利技术属性】
技术研发人员：曹云龙，X·S·谢，
申请(专利权)人：哈佛学院董事及会员团体，
类型：发明
国别省市：美国;US