【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增加NADPH的生物合成途径的基因组工程化相关申请的交叉引用本申请要求2017年5月19日提交的美国临时申请第62/508,589号的优先权益，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。关于序列表的陈述与本申请相关的序列表以文本格式代替纸本拷贝提供，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是ZYMR_011_01WO_SeqList_ST25.txt。所述文本文件是950KB，创建于2018年5月18日，并且以电子方式通过EFS-Web提交。
本公开大体上是针对增加微生物细胞中的NADPH可用性的微生物工程化方法。具体地说，本公开涉及通过在宿主细胞中表达以下中的一或多种将宿主细胞进行工程化以增加NADPH可用性：改变的GAPDH、变异谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，gdh)、天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartatesemialdehydedehydrogenase，asd)、二氢吡啶甲酸还原酶(dihydropicolinatereductase，dapB)、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelatedehydrogenase，ddh)、苏氨酸醛缩酶(threoninealdohase，ltaE)、丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase，pyc)和新颖烟酰胺核苷酸转氢酶。
技术介绍
NADPH作为一种还原当量，与用于合成如糖和例如L-赖氨酸和L-苏氨酸等氨基酸的工业上重要化合物的许多重要生物过...
【技术保护点】
1.一种提高微生物细胞产生使用NADPH产生的化合物的能力的方法，所述方法包含改变所述细胞的可利用的NADPH。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170519 US 62/508,5891.一种提高微生物细胞产生使用NADPH产生的化合物的能力的方法，所述方法包含改变所述细胞的可利用的NADPH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可利用的NADPH通过在所述细胞中表达经修饰的甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH来改变，其中所述经修饰的GAPDH经过修饰以使得其辅酶特异性加宽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过在所述微生物细胞中表达酶谷氨酸脱氢酶gdh、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、二氢吡啶甲酸还原酶dapB和内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶ddh中的一或多种酶的变异酶来改变所述细胞的可利用的NADPH，其中所述变异酶展现针对辅酶NADH和NADPH的双特异性。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH相对于对应的天然存在的GAPDH具有增加的针对辅酶NADP的特异性。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌细胞来自选自由棒状杆菌属、埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属或土芽孢杆菌属组成的群组的细菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌是谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
8.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物细胞是酵母细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酵母细胞是来自酵母菌属的细胞。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述天然存在的GAPDH是gapA。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述gapA具有SEQIDNO:58的氨基酸序列。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH包含与SEQIDNO:58的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH包含与选自由SEQIDNO:294、296、233、234、235、236、298和300组成的群组的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH在与SEQIDNO:58的氨基酸37相对应的位置处包含氨基酸置换。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH在与SEQIDNO:58的氨基酸36和37相对应的位置处包含氨基酸置换。
16.根据权利要求14所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸37相对应的位置处的苏氨酸已经被赖氨酸置换。
17.根据权利要求15所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸36相对应的位置处的亮氨酸已经被苏氨酸置换，并且在与SEQIDNO:58的氨基酸37相对应的位置处的苏氨酸已经被赖氨酸置换。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH在与SEQIDNO:58的氨基酸192相对应的位置处包含氨基酸置换。
19.根据权利要求2所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸172相对应的位置处的脯氨酸已经被丝氨酸置换。
20.根据权利要求2所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸224相对应的位置处的亮氨酸已经被丝氨酸置换。
21.根据权利要求2所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸110相对应的位置处的组氨酸已经被天冬氨酸置换。
22.根据权利要求2所述的方法，其中在与SEQIDNO:58的氨基酸140相对应的位置处的酪氨酸已经被甘氨酸置换。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述经修饰的GAPDH选自由SEQIDNO:69、71、73、303、294、296、233、234、235、236、298和300组成的群组。
24.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物选自表2。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述化合物是L-赖氨酸或L-苏氨酸。
26.一种微生物细胞，其包含相对于天然存在的GAPDH具有加宽的辅酶特异性的经修饰的GAPDH，其中相对于缺乏所述经修饰的GAPDH的对应微生物细胞，所述微生物细胞提高使用NADPH产生的化合物的产生。
27.根据权利要求26所述的微生物细胞，其中所述经修饰的GAPDH相对于所述天然存在的GAPDH具有增加的针对NADP的特异性。
28.根据权利要求27所述的微生物细胞，其中所述经修饰的GAPDH包含与SEQIDNO:58至少70％一致的氨基酸序列。
29.根据权利要求27所述的微生物细胞，其中所述经修饰的GAPDH包含与选自由SEQIDNO:294、296、233、234、235、236、298和300组成的群组的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
30.根据权利要求27所述的微生物细胞，其中所述经修饰的GAPDH包含与SEQIDNO:58至少70％一致的氨基酸序列并且其中所述经修饰的GAPDH包含在SEQIDNO:58的位置36、37或两个位置处的氨基酸的取代。
31.根据权利要求27所述的微生物细胞，其中所述经修饰的GAPDH选自由SEQIDNO:69、71、73、303、294、296、233、234、235、236、298和300组成的群组。
32.根据权利要求26所述的微生物细胞，其中所述化合物选自表2。
33.根据权利要求32所述的微生物细胞，其中所述化合物是L-赖氨酸或L-苏氨酸。
34.根据权利要求26所述的微生物细胞，其中所述微生物细胞来自细菌。
35.根据权利要求34所述的微生物细胞，其中所述细菌是棒状杆菌属、埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属或土芽孢杆菌属。
36.根据权利要求35所述的微生物细胞，其中所述细菌是谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
37.根据权利要求33所述的微生物细胞，其中所述微生物细胞是酵母细胞。
38.一种加宽GAPDH的辅酶特异性的方法，其包含：对所述GAPDH进行修饰以使得经修饰的GAPDH具有针对辅酶NADP和NAD的双特异性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中相对于NAD，所述经修饰的GAPDH具有增加的针对辅酶NADP的特异性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中相比于NAD，所述经修饰的GAPDH更有效地使用NADP。
41.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达gdh的变异酶，其中所述变异酶包含与SEQIDNO:42或44的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
42.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达asd的变异酶，其中所述变异酶包含与SEQIDNO:30或40的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
43.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达dapB的变异酶，其中所述变异酶包含与SEQIDNO:46或48的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
44.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达ddh的变异酶，其中所述ddh酶包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。
45.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达gdh的变异酶，其中所述变异酶包含与选自由SEQIDNO:132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180和182组成的群组的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
46.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包含表达asd的变异酶，其中所述变异酶包含与选自由SEQIDNO:80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128和130组成的群组的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列。
47.根据权利要求3所述的方法，其中所有四种酶的变体同时在所述微生物细胞中表达。
48.一种微生物细胞，其包含：一或多种酶gdh、asd、dapB和ddh的变体，其中所述变体展现针对辅酶NADH和NADPH的双特异性。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述gdh的变异酶包含选自由SEQID...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·曼彻斯特，B·梅森，A·戈拉诺夫，
申请(专利权)人：齐默尔根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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