提高细胞基因编辑效率的方法技术

本文提供用PFTα或bFGF改善细胞中核酸酶介导基因打靶频率的方法。

Methods to improve the efficiency of cell gene editing

In this paper, PFT \u03b1 or bFGF are used to improve the targeting frequency of nuclease mediated genes in cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高细胞基因编辑效率的方法相关申请信息本申请要求于2017年2月1日提交的第62/453,051号美国临时申请的优先权，并通过引用将其整体纳入本文用于所有目的。政府权益声明本专利技术得到国立卫生院(国家人类基因组研究所)第P50HG005550-05号政府资助。政府对本专利技术拥有一定的权利。
本文总体涉及基因编辑。
技术介绍
现有细胞基因组编辑方法在一个或多个位置切割基因组，例如通过使用核酸酶。采用序列特异性核酸酶的基因组编辑是已知的。核酸酶介导的基因组内双链DNA(dsDNA)断裂可被两种主要机制修复：非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(NHEJ)，前者经常造成引入非特异性的插入和缺失(indels)，后者吸纳同源链作为修复模板。当序列特异性核酸酶与包含所需突变的同源供体DNA构建体一起递送时，基因打靶效率相较仅递送供体构建体提升1000倍。已经开发出了另外的方法来加速基因组修饰过程，这些方法直接将位点特异性核酸酶的DNA或mRNA注入细胞(例如胚胎细胞)在特定基因座产生DNA双链断裂(DSB)。这些位点特异性核酸酶诱导的DSB然后可被易错的非同源性末端连接(NHEJ)修复，得到例如在切割位点携带缺失或插入的变异小鼠和大鼠。如果连同与DSB两侧末端有同源性的供体质粒共同注入，那么高保真的同源性重组可以产生具有靶向整合的动物。此类基因组编辑方法包括锌指核酸酶(ZNF)或TAL效应子核酸酶(如转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))。CRISPRII型系统已被用于编辑多个物种的基因组(参见例如Friedland等，2013；Mali等，2013；Hwang等，2013；Jiang等，2013；Jinek等，2013；Cong等，2013；Yin等，2014)。CRISPR可特别定制，因为活性形式由不变的Cas9蛋白和易于设计的单链向导RNA(sgRNA)组成。Jinek等，2012。各种CRISPR直向同源物中，化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes(Sp))CRISPR是认知最充分、应用最广泛的。Cas9-gRNA复合物首先探测原间隔区相邻基序(PAM)序列(对SpCas9来说即-NGG)的DNA，此后，sgRNA与靶DNA之间的Watson-Crick碱基配对以棘轮机制进行，形成一个R-环。形成Cas9、sgRNA和靶DNA三元复合物后，Cas9蛋白在靶DNA中产生两个缺口，造成钝端双链断裂(DSB)，这些断裂通过非同源末端连接(NHEJ)途径或模板引导的同源重组(HR)修复。CRISPR方法可见例如US9,023,649和US8,697,359。CRISPR/Cas9核酸酶的开发极大地扩展了我们在细胞内工程化定制遗传改变的能力(Mali等，2013)。在某些方面，如本领域所知，脱氨酶可用来修饰某些核苷酸。脱氨酶被用来修饰细胞DNA。然而，有些细胞对造成DNA损伤的基因组编辑在基因编辑率或存活率方面有不良反应。因此需要在细胞内工程化定制遗传改变(例如采用CRISPR/Cas9时)的更好的方法，其中遗传修饰的细胞能够形成动物(例如猪)用作器官移植的潜在来源。
技术实现思路
本文多项内容涉及提高细胞内核酸酶介导基因编辑效率的方法。本文多项内容涉及抑制遗传修饰细胞凋亡的方法，包括在细胞遗传修饰之前、期间或之后向细胞提供外源性PFTα或bFGF。据内容之一，所述遗传修饰导致细胞内多个靶核酸序列断裂。据内容之一，在细胞遗传修饰期间向细胞提供PFTα和bFGF。本文提供抑制遗传修饰细胞中凋亡的方法，包括在细胞遗传修饰期间向细胞提供外源性PFTα或bFGF，其中遗传修饰导致细胞内多个靶核酸序列的断裂。据内容之一，PFTα或bFGF从所述细胞所处培养基中提供给所述细胞。据内容之一，对所述细胞进行遗传修饰以包括编码核酸酶的核酸序列，所述核酸酶表达后切割靶核酸序列。据内容之一，核酸酶是Cas核酸酶、Cas切口酶、结合核酸酶的无核酸酶Cas、锌指核酸酶、大型核酸酶(meganuclease)或TALEN。据内容之一，细胞是原核细胞或真核细胞。据内容之一，细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、合子或生殖细胞。据内容之一，细胞是体细胞或原代细胞。据内容之一，细胞是动物细胞。据内容之一，细胞是猪细胞。据内容之一，多个靶核酸序列包含猪内源性逆转录病毒(PERV)基因。据内容之一，PERV基因包括pol基因。据内容之一，pol基因的一个或多个拷贝失活。据内容之一，细胞中pol基因的拷贝全部失活。本文多项内容提供工程化或遗传修饰的细胞，其包含编码可编程核酸酶的外源性核酸序列和外源性PFTα或bFGF，所述核酸酶表达后切割靶核酸序列。据内容之一，核酸酶是Cas核酸酶、Cas切口酶、结合核酸酶的无核酸酶Cas、锌指核酸酶、大型核酸酶或TALEN。据内容之一，细胞是原核细胞或真核细胞。据内容之一，所述细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、合子或生殖细胞。据内容之一，细胞是体细胞或原代细胞。据内容之一，细胞是动物细胞。据内容之一，细胞是猪细胞。据内容之一，多个靶核酸序列包含猪内源性逆转录病毒(PERV)基因。据内容之一，PERV基因包括pol基因。据内容之一，pol基因的一个或多个拷贝失活。据内容之一，细胞中pol基因的拷贝全部失活。附图说明图1的数据图显示PFTα和bFGF处理可防止衰老并能够分离得到100％无PERV的克隆细胞系。图2的数据图显示源自遗传修饰期间接受PFTα和bFGF处理的PFFF3群的各个扩增克隆中的PERV打靶效率。详细说明本文提供限制、减少、抑制或消除与细胞(例如原代细胞)内基因组编辑相关不良作用(例如毒性)的方法，其中DNA损伤可导致不良作用。例如，基于核酸酶的基因组编辑(例如采用CRISPR/Cas系统的)会产生严重限制靶细胞内基因编辑的毒性。本文提供限制、减少、抑制或消除这种毒性并改善靶细胞内基因打靶频率的方法，通过采用小分子p53抑制剂，例如PFTα(pifithrinα)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。见Grandela等(2007)，“p53是依托泊苷诱导人胚胎干细胞凋亡所必需的(p53isrequiredforetoposide-inducedapoptosisofhumanembryonicstemcells)”，StemCellResearch1，116–128和Qin等(2007)，“p53对人胚胎干细胞凋亡和分化的调节(RegulationofApoptosisandDifferentiationbyp53inHumanEmbryonicStemCells)”，JournalofBiologicalChemistry282,5842–5852，以上均通过引用整体纳入本文。据内容之一，猪细胞内的猪内源性逆转录病毒(PERV)元件被遗传修饰，用于产生缺乏活性PERV的猪细胞系和动物并成为异种移植治疗的有用资源。灭活PERV允许异种移植成为提供人类移植用器官的策略，就免疫不相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制遗传修饰细胞凋亡的方法，包括在细胞遗传修饰之前、期间或之后向细胞提供外源性PFTα或bFGF。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170201 US 62/453,0511.一种抑制遗传修饰细胞凋亡的方法，包括在细胞遗传修饰之前、期间或之后向细胞提供外源性PFTα或bFGF。


2.如权利要求1所述的方法，其中在细胞遗传修饰期间向细胞提供PFTα和bFGF。


3.如权利要求1所述的方法，PFTα或bFGF从所述细胞所处培养基中提供给所述细胞。


4.如权利要求1所述的方法，对所述细胞进行遗传修饰以包括编码核酸酶的核酸序列，所述核酸酶表达后切割靶核酸序列。


5.如权利要求4所述的方法，所述核酸酶是Cas核酸酶、Cas切口酶、结合核酸酶的无核酸酶Cas、锌指核酸酶、大型核酸酶或TALEN。


6.如权利要求1所述的方法，所述细胞是原核细胞或真核细胞。


7.如权利要求1所述的方法，所述细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、合子或生殖细胞。


8.如权利要求1所述的方法，所述细胞是体细胞或原代细胞。


9.如权利要求1所述的方法，所述细胞是动物细胞。


10.如权利要求1所述的方法，所述细胞是猪细胞。


11.如权利要求1所述的方法，所述多个靶核酸序列包含猪内源性逆转录病毒(PERV)基因。


12.如权利要求11所述的方法，所述PERV基因包括pol基因。


13.如权利要求12所述的方法，所述pol基因的一个或多个拷贝失活。


14.如权利要求13所述的方法，其中，所述细胞中pol基因的拷贝全部失活。


15.一种工程化细胞，其包含编码可编程核酸酶的外源性核酸序列，所述可编程核酸酶表达后切割靶核酸序列，和
外源性PFTα或bFGF。


16.如权利要求15所述的工程化细胞，所述核酸酶是Cas核酸酶、Cas切口酶、结合核酸酶的无核酸酶Cas、锌指核酸酶、大型核酸酶或TALEN。


17.如权利要求15所述的工程化细胞，所述细胞是原核细胞或真核细胞。


18.如权利要求15所述的工程化细胞，所述细胞是干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、合子或生殖细胞。


19.如权利要求15所述的工程化细胞，所述细胞是体细胞或原代细胞。


20.如权利要求15所述的工程化细胞，所述细胞是动物细胞。


21.如权利要求15所述的工程化细胞，所述细胞是猪细胞。


22.如权利要求15所述的工程化细胞，所述多个靶核酸序列包含猪内源性逆转录病毒(PERV)基因。


23.如权利要求22所述的工程化细胞，所述PERV基因包括pol基因。


24.如权利要求23所述的方法，所述pol基因的一个或多个拷贝失活。


25.如权利要求24所述的方法，所述细胞中pol基因的拷贝全部失活。


26.如权利要求1所述的方法，所述遗传修饰导致细胞内多个靶核酸序列断裂。


27.一种提高遗传修饰细胞内基因编辑率的方法，包括在细胞遗传...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·M·丘奇，杨璐菡，
申请(专利权)人：哈佛学院董事及会员团体，
类型：发明
国别省市：美国;US