一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法。具体包括以下步骤：确定asap1b基因敲除的靶点位置即asap1b‑gRNA‑Cas9靶位点，体外转录获得asap1b‑gRNA，将asap1b‑gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼受精卵中，筛选培养获得稳定遗传的asap1b基因敲除突变体。本发明专利技术根据选择的一段位于asap1b基因第1个外显子的高效率打靶序列，利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼中的asap1b基因并产生可稳定遗传的asap1b基因敲除斑马鱼，且本发明专利技术共获得了3种突变类型的asap1b基因敲除斑马鱼品系，均对Asap1b蛋白翻译造成了提前终止，对研究asap1b基因的功能奠定动物模型基础。

A method of construction of zebrafish asap1b gene knockout mutant by CRISPR / cas9 Technology

The invention discloses a method for constructing a zebrafish asap1b gene knockout mutant by using CRISPR / cas9 technology. The specific steps are as follows: determine the target site of asap1b gene knockout, that is, asap1b \u2011 gRNA \u2011 cas9 target site, obtain asap1b \u2011 gRNA by transcription in vitro, transfer asap1b \u2011 gRNA and cas9mrna into zebrafish fertilized eggs, screen and culture the stable genetic asap1b gene knockout mutants. According to a highly efficient targeting sequence selected at the first exon of asap1b gene, the invention knocks out the asap1b gene in zebrafish by CRISPR / cas9 technology and produces a stable genetic asap1b gene knockout zebrafish. In addition, three types of asap1b gene knockout zebrafish strains are obtained by the invention, which cause early termination of asap1b protein translation and research of asap1b base Because of the function of the animal model.

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法
本专利技术涉及一种基因工程斑马鱼突变体
，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御系统，当细菌遭受病毒的侵染时，会在自身基因组里留下外源基因片段作为“记忆抗体”以识别再次侵入的病毒。CRISPR/Cas系统由CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)元件和编码一系列Cas蛋白的基因组成，其中CRISPR元件由多个相同的重复序列(repeat)与不同的间隔序列(spacer)交替排列组成。该系统工作的原理为：细菌依靠Cas蛋白捕获外源性核酸片段并将其插入到基因组CRISPR元件的间隔序列中，这样CRISPR元件在转录过程中将携带有外源基因片段的新的间隔序列也同时转录，形成新的crRNA，内源性Cas蛋白复合物在成熟的crRNA的序列引导下特异性识别与新的插入间隔序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性；/nS2.制备asap1b-gRNA；/nS3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA共同导入斑马鱼胚胎中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列突变效率；/nS4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本；/nS5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突...

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性；
S2.制备asap1b-gRNA；
S3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA共同导入斑马鱼胚胎中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列突变效率；
S4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本；
S5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型；
S6.筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1b基因敲除突变体的构建。


2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列为SEQIDNO.1所示序列，且位于斑马鱼asap1b基因第1个外显子。


3.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2中制备asap1b-gRNA的方法为：
S2.1将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；
S2.2从重组的pDR274-asap1b-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1b-gRNA；
S2.3扩增产物进行PCR产物回收并通过体外转录得到asap1b-gRNA。


4.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.1中将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列。


5.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.2中扩增T7promoter-asap1b-gRNA引物序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示序列。


6.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3中将asap1b-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点突变效率，具体为：
S3.1将体外转录获得的asap1b-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1b-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9mRNA终浓度为300ng/μL，导入体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔佳，吴长新，赵仲华，温炟，王玉环，
申请(专利权)人：山西大学，长治医学院，
类型：发明
国别省市：山西;14