一种长单链DNA的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种借助I类和II类水解性脱氧核酶高效制备长单链DNA的方法。该方法主要包括设计并构建重组噬菌粒，获得噬菌粒环状单链DNA步骤，同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA，纯化回收酶切得到的所述长单链DNA。利用这两类能快速水解DNA的脱氧核酶，可代替限制性内切酶，低成本的实现对辅助噬菌体法制备出的DNA序列的特异性切割，大量、经济、高纯度制备任意长度和序列的单链DNA。

A preparation method of long single stranded DNA

【技术实现步骤摘要】
一种长单链DNA的制备方法
本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种利用两类能快速水解DNA的脱氧核酶，结合辅助噬菌体制备长单链DNA的方法。
技术介绍
目前，DNA纳米技术，基因编辑如knockin(基因敲入)等生物医学研究领域对单链DNA(SinglestrandDNA,ssDNA)，尤其对长单链DNA(>100个碱基)具有广泛需求。然而，受化学合成方法的限制，长单链DNA的合成难以保证产率、产量和满意的性价比，因此对于长单链DNA需要借助于生物酶的体内或体外作用以及一些辅助变性的手段，目前常用的长单链DNA的制备方法主要有反转录法，酶降解法，变性高效液相色谱(HPLC)法，磁珠生物素(Biotin)修饰法，非对称PCR法，RCA法等。但在实际应用中，这些方法都存在产率低下、成本高昂等问题。辅助噬菌体法是一种较新的制备单链DNA的方法。其基本原理是构建一个含有M13复制起始点(M13ori)或者f1复制起始点(f1ori)的质粒，转入到含有F'因子的宿主细胞中，再用一个有缺陷的辅助噬菌体去感染。辅助噬菌体可以帮助该质粒形成单链DNA并包裹成噬菌体，分泌出宿主细胞(如图1所示)。该方法成本低、产量高，是一种非常适合长单链DNA序列制备的方法。但其形成的单链DNA为环状，且含有一段必需的M13ori/f1ori保守序列。若采用传统的限制性内切酶酶切的方法获得想要的单链DNA部分，则会极大提高制备成本。同时该方法受限于内切酶对DNA识别序列的依赖性。而脱氧核酶(Deoxyribozyme)是一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，可以催化包括DNA的磷酸化、腺苷化、去糖基化等多种化学反应。近年来，也有研究者筛选出了以Zn2+作为辅助因子、能够在特定位点水解DNA磷酸二酯键的脱氧核酶，并利用脱氧核酶水解单链DNA。但是现有技术中利用I类脱氧核酶进行切割反应，所得单链DNA5’端残留AG两个碱基，3’端残留GTTGA五个碱基，并不能实现单链DNA序列完全自定义，不能完全满足探针制备等实际应用中的需求。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术利用两类能快速水解DNA的脱氧核酶代替限制性内切酶，可以低成本的实现对辅助噬菌体法制备出的DNA序列的特异性切割，获得任意长度和序列的单链DNA。一方面，本专利技术提供了一种长单链DNA的制备方法，包括同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA的步骤。可选择地，所述I类脱氧核酶为I-R3，其底物域序列如SEQIDNO：1所示，酶域序列如SEQIDNO：2所示的序列。可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d中的一种。所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a的底物域序列如SEQIDNO：3所示，酶域序列如SEQIDNO：4所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1b的底物域序列如SEQIDNO：5所示，酶域序列如SEQIDNO：6所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1c的底物域序列如SEQIDNO：7所示，酶域序列如SEQIDNO：8所示的序列；所述II类脱氧核酶突变体为II-R1d的底物域序列如SEQIDNO：9所示，酶域序列如SEQIDNO：10所示的序列。所述II类脱氧核酶突变体的茎干区域序为任意核苷酸序列。可选地，在所述切割环状单链DNA的步骤中，在收集的环状单链DNA中，加入脱氧核酶切割反应缓冲液1(50mMHEPES，100mMLiCl，pH7.0)。若脱氧核酶以两条链的形式，即拆分成底物链和酶链发生切割，通过PCR分别在目的序列两端加入I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体的底物域序列，脱氧核酶水解切割时则另加入相应的脱氧核酶酶序列。其中，根据所要制备的单链序列3’端最后一个碱基，选择相对应的II类脱氧核酶突变体。如3’端最后一个碱基为G，选择II-R1a；如3’端最后一个碱基为A，选择II-R1b；如3’端最后一个碱基为T，选择II-R1c；如3’端最后一个碱基为C，选择II-R1d。若脱氧核酶底物域和酶域在一条序列上，以一条序列的形式发生切割时，通过PCR分别在目的序列两端加入I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体序列。变性退火后加入脱氧核酶切割反应缓冲液2(50mMHEPES，100mMLiCl，20mMMgCl2，4mMZnCl2，pH7.0)，在37℃至50℃范围内进行切割，具体反应温度视脱氧核酶茎干区域长度而定，切割时间根据实际需求半小时至24小时不等。可选择地，在切割环状单链DNA的步骤之前，还包括设计并构建重组噬菌粒，以及获得噬菌粒环状单链DNA步骤。可选择地，所述设计并构建重组噬菌粒，可根据不同的应用需求，设计目标单链DNA的长度和序列。可以使用不同质粒或不同生物基因组为模板进行PCR扩增以获得DNA片段，或直接化学合成DNA片段；DNA片段长度可设计为从几十个碱基对至几万个碱基对不等。可选择地，所述设计并构建重组噬菌粒包括，在目标单链DNA序列的5'端和3'端分别添加I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体序列，或者分别添加I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体底物域序列。在此基础上，在DNA片段两边添加酶切位点或载体同源序列。所扩增的DNA片段可以通过酶切、连接反应或同源重组法连接到含有M13ori或f1ori的噬菌粒载体上，构建重组噬菌粒。可选择地，所述获得噬菌体环状单链DNA包括，将上述构建好的重组噬菌粒转化进入含有F因子的大肠杆菌细胞(如JM109，XL-1blue)中，在大肠杆菌体内进行大量复制。之后通过辅助噬菌体(如M13KO7，VCSM13)的侵染，重组噬菌粒将以单链的形式包裹于噬菌体中，并一同被分泌到细胞培养液中。通过离心除去大肠杆菌，收集上清并沉淀噬菌体颗粒，再利用碱裂解法剥去噬菌体蛋白外壳，即可得到对应的环状单链DNA。可选择地，在切割环状单链DNA的步骤之后，还包括纯化回收酶切得到的所述长单链DNA，具体为在切割反应完成之后，根据目标单链DNA序列长度，选择合适浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，去除多余的载体序列和脱氧核酶序列。通过胶回收试剂盒或凝胶洗脱缓冲液可回收得到目标单链DNA。第二方面，本专利技术还提供了所述的长单链DNA的制备方法在DNA纳米、基因编辑、基因治疗等方面的应用。第三方面，本专利技术还提供了所述的长单链DNA的制备方法制得的长单链DNA，在DNA纳米、基因编辑、基因治疗、DNA探针等方面的应用。可选地，在knockin实验中的应用。本专利技术相对于现有技术的有益效果：1)现有技术中利用I类脱氧核酶进行切割反应，所得单链DNA5’端残留AG两个碱基，3’端残留GTTGA五个碱基，而本专利技术利用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体同时进行切割反应，所制备出的单链DNA仅5’端残留AG两个碱基，3’端无残留碱基，且切割效率均可达70％以上。在实际应用中，5’端残留的AG碱基可设计包含在所需制备的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，包括同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，包括同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA的步骤。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶为I-R3，其底物域序列如SEQIDNO：1所示，酶域序列如SEQIDNO：2所示的序列。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d中的一种。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a的底物域序列如SEQIDNO：3所示，酶域序列如SEQIDNO：4所示的序列；或
所述II类脱氧核酶突变体为II-R1b的底物域序列如SEQIDNO：5所示，酶域序列如SEQIDNO：6所示的序列；或
所述II类脱氧核酶突变体为II-R1c的底物域序列如SEQIDNO：7所示，酶域序列如SEQIDNO：8所示的序列；或
所述II类脱氧核酶突变体为II-R1d的底物域序列如SEQIDNO：9所示，酶域序列如SEQIDNO：10所示的序列。


5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾宏周，张俏，夏凯，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31