【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】探针文库构建相关申请本申请要求由Zhuang等人于2014年9月15日提交的题为“ProbeLibraryConstruction”的美国临时专利申请系列号62/050,636;由Zhuang等人于2014年7月30日提交的题为“SystemsandMethodsforDeterminingNucleicAcids”的美国临时专利申请序列号62/031,062;以及由Zhuang等人于2015年4月3日提交的题为“SystemsandMethodsforDeterminingNucleicAcids”的美国临时专利申请系列号62/142,653的权益。上述每一篇通过引用并入本文。政府资金本专利技术是在由国立卫生研究院授予的基金号GM096450的政府支持下进行的。政府对本专利技术具有一定的权利。领域本专利技术一般涉及用于产生核酸的系统和方法。背景定制合成的寡核苷酸探针已经作为用于通过杂交鉴定和分离特定核酸靶的有力工具而出现。这样的杂交探针组的应用范围从下一代测序(其中这样的探针用于富集或耗尽特定核酸靶的样品)到固定样品的成像(其中荧光标记的杂交探针允许直接测量目标物种的数量和空间组织)。现在存在这样的探针的广泛的商业来源。这样的探针通常通过使用标准固相合成方法合成每个寡核苷酸成员来制备。遗憾的是,由于要求每个寡核苷酸成员必须个别地和单独地合成,这限制了单一集合内的探针数量和独特集合的数量。最近在几个公司的基于阵列的寡核苷酸合成中的进展降低了生产寡核苷酸的成本。然而,这些方法也导致作为单一杂交反应所需的寡核苷酸探针的1000分之一的寡核苷酸探针,因此限制了它们 ...
【技术保护点】
一种方法,包括:使用实时PCR扩增多个寡核苷酸中的至少一些以产生扩增的寡核苷酸;体外转录至少一些所述扩增的寡核苷酸以产生RNA;逆转录所述RNA以产生转录的DNA;和相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.30 US 62/031,062;2014.09.15 US 62/050,636;1.一种方法,包括:使用实时PCR扩增多个寡核苷酸中的至少一些以产生扩增的寡核苷酸;体外转录至少一些所述扩增的寡核苷酸以产生RNA;逆转录所述RNA以产生转录的DNA;和相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA。2.权利要求1的方法,其中所述多个寡核苷酸具有10至200个核苷酸的平均长度。3.权利要求1或2中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包括至少10个独特的寡核苷酸序列。4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包括至少100个独特的寡核苷酸序列。5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包括至少1,000个独特的寡核苷酸序列。6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包括至少10,000个独特的寡核苷酸序列。7.权利要求1-6中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包括至少100,000个独特的寡核苷酸序列。8.权利要求1-7中任一项的方法,其中所述独特的寡核苷酸序列各自包含在所述独特的寡核苷酸序列中相同的第一区域和在所述独特的寡核苷酸序列中不同的第二区域。9.权利要求8的方法,其中所述独特的寡核苷酸序列各自包含在所述独特的寡核苷酸序列中相同的第三区域,其中所述第二区域分隔所述第一区域和所述第三区域。10.权利要求1-9中任一项的方法,其中扩增至少一些所述多个寡核苷酸包括将至少一些所述多个寡核苷酸暴露于含有引物的序列。11.权利要求10的方法,其中至少一些所述含有引物的序列还包含启动子,由此将所述启动子添加至至少一些所述扩增的寡核苷酸。12.权利要求1-10中任一项的方法,其中至少一些所述扩增的寡核苷酸含有启动子。13.权利要求11或12中任一项的方法,其中所述启动子是T7启动子。14.权利要求11或12中任一项的方法,其中所述启动子是T3启动子。15.权利要求11或12中任一项的方法,其中所述启动子是SP6启动子。16.权利要求1-15中任一项的方法,其中至少一些所述多个寡核苷酸包含具有第一共同索引区域的至少第一组寡核苷酸和具有可与第一共同索引区域区分的第二共同索引区域的第二组寡核苷酸。17.权利要求16的方法,包括扩增所述第一组寡核苷酸,但不扩增所述第二组寡核苷酸。18.权利要求16或17中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少2组寡核苷酸。19.权利要求16-18中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少4组寡核苷酸。20.权利要求16-19中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少10组寡核苷酸。21.权利要求16-20中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少20组寡核苷酸。22.权利要求16-21中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少96组寡核苷酸。23.权利要求16-22中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少100组寡核苷酸。24.权利要求16-23中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸包含具有可区分的共同索引区域的至少192组寡核苷酸。25.权利要求1-24中任一项的方法,其中扩增至少一些所述多个寡核苷酸包括产生包含所述多个寡核苷酸中的一个寡核苷酸和启动子的扩增的寡核苷酸。26.权利要求1-27中任一项的方法,其中转录至少一些所述扩增的寡核苷酸包括作为扩增的寡核苷酸的量的至少100倍的RNA的量。27.权利要求1-26中任一项的方法,其中转录至少一些所述扩增的寡核苷酸包括将所述扩增的寡核苷酸暴露于RNA聚合酶。28.权利要求27的方法,其中所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。29.权利要求27的方法,其中所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶。30.权利要求27的方法,其中所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶。31.权利要求27的方法,其中所述RNA聚合酶是RNA聚合酶I,RNA聚合酶II,RNA聚合酶III,RNA聚合酶IV或RNA聚合酶V。32.权利要求27的方法,其中所述RNA聚合酶是病毒RNA聚合酶。33.权利要求1-32中任一项的方法,其中转录至少一些扩增的寡核苷酸以产生RNA包括产生平均每个所述扩增的寡核苷酸至少10个RNA拷贝。34.权利要求1-33中任一项的方法,其中转录至少一些扩增的寡核苷酸以产生RNA包括产生平均每个所述扩增的寡核苷酸至少100个RNA拷贝。35.权利要求1-34中任一项的方法,其中转录至少一些扩增的寡核苷酸以产生RNA包括产生平均每个所述扩增的寡核苷酸至少1,000个RNA拷贝。36.权利要求1-35中任一项的方法,其中转录至少一些扩增的寡核苷酸以产生RNA包括产生平均每个所述扩增的寡核苷酸至少10,000个RNA拷贝。37.权利要求1-36中任一项的方法,其中逆转录所述RNA包括将所述RNA暴露于逆转录酶。38.权利要求37的方法,其中所述逆转录酶是病毒逆转录酶。39.权利要求1-38中任一项的方法,其中逆转录所述RNA以产生转录的DNA而不首先从用于产生所述RNA的组分中纯化所述RNA。40.权利要求1-39中任一项的方法,还包括在逆转录所述RNA以产生转录的DNA之前从用于产生所述RNA的组分中纯化所述RNA。41.权利要求1-40中任一项的方法,其中逆转录所述RNA以产生转录的DNA包括使用含有转录引物的序列逆转录所述RNA以产生转录的DNA。42.权利要求41的方法,其中所述含有转录引物的序列被掺入所述转录的DNA中。43.权利要求41或42中任一项的方法,其中所述含有转录引物的序列还包含生物素部分。44.权利要求41-43中任一项的方法,其中所述含有转录引物的序列还包含地高辛部分。45.权利要求41-44中任一项的方法,其中所述含有转录引物的序列还包含荧光团。46.权利要求41-45中任一项的方法,其中所述含有转录引物的序列还包含非核酸部分。47.权利要求41-46中任一项的方法,其中所述含有转录引物的序列还包含与其连接的信号传导实体。48.权利要求47的方法,其中所述信号传导实体是荧光的。49.权利要求47或48中任一项的方法,其中所述信号传导实体是可在能够发射第一波长的光的第一状态与不能发射所述第一波长的光的第二状态之间光切换的。50.权利要求47-49中任一项的方法,其中所述信号传导实体是可光激活的。51.权利要求47的方法,其中所述信号传导实体是核酸序列。52.权利要求51的方法,其中所述另外的核酸序列能够通过Watson-Crick碱基配对与含有另外的信号传导实体的第二核酸序列选择性杂交。53.权利要求1-52中任一项的方法,其中相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA包括化学还原所述RNA。54.权利要求1-53中任一项的方法,其中相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA包括将所述RNA暴露于至少约9的pH。55.权利要求1-54中任一项的方法,其中相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA包括使所述RNA经历碱性水解。56.权利要求1-55中任一项的方法,其中相对于所述转录的DNA选择性降解所述RNA包括酶促消化所述RNA。57.权利要求1-56中任一项的方法,其中所述转录的DNA基本上是单链的。58.权利要求1-57中任一项的方法,其中所述步骤以所记载的顺序进行。59.权利要求1-58中任一项的方法,还包括纯化所述转录的DNA。60.权利要求59的方法,包括通过柱纯化来纯化所述转录的DNA。61.权利要求59或60中任一项的方法,包括通过乙醇沉淀纯化所述转录的DNA。62.权利要求59-61中任一项的方法,包括通过固相可逆固定化来纯化所述转录的DNA。63.权利要求1-62中任一项的方法,还包括浓缩所述转录的DNA。64.权利要求63的方法,包括通过蒸发浓缩所述转录的DNA。65.权利要求1-64中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸是计算设计的。66.权利要求1-65中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸是合成产生的。67.权利要求1-66中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸来自细胞。68.权利要求1-67中任一项的方法,其中所述多个寡核苷酸在基底上产生。69.权利要求68的方法,其中所述多个寡核苷酸在基底上的阵列中产生。70.权利要求1-69中任一项的方法,还包括分离所述DNA的子集。71.权利要求1-70中任一项的方法,其中所述寡核苷酸的子集中的每个寡核苷酸包含相同的索引部分。72.权利要求1-71中任一项的方法,其中所述寡核苷酸的子...
【专利技术属性】
技术研发人员:庄小威,J·R·墨菲特,A·波蒂格,
申请(专利权)人:哈佛学院院长及董事,
类型:发明
国别省市:美国,US
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