一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，所述测定方法收集结核分枝杆菌感染后的细胞或组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总DNA和总RNA，总RNA反转录得到cDNA；用结核分枝杆菌的cDNA引物、人的内参基因DNA引物分别对同一个体的cDNA及DNA进行Real‑time qPCR绝对定量，根据结核分枝杆菌RNA的拷贝数/人内参基因DNA的拷贝数得到结核分枝杆菌的存活率。本发明专利技术操作简单，测得结果准确度高，实验误差小，通过细胞/组织内结核分枝杆菌16sRNA水平表达量与人内参基因水平的比值作为评估细菌生存能力的指标。此指标可用于评价结核感染的严重程度及临床药物治疗效果。

Method for determining bacterial survival rate after Mycobacterium tuberculosis infection in human body

The invention discloses a human body infected with Mycobacterium tuberculosis bacteria survival rate determination method, the measurement method of cell or tissue collection of Mycobacterium tuberculosis infection after extraction, cell / tissue total DNA of Mycobacterium tuberculosis and total RNA, total RNA reverse transcription cDNA; with DNA gene primers, primer cDNA Mycobacterium tuberculosis who were of the same individual cDNA and DNA Real time qPCR absolute quantification, according to Mycobacterium tuberculosis RNA copy number / copy number one reference gene DNA obtained the survival rate of Mycobacterium tuberculosis. The invention has the advantages of simple operation, high accuracy of measurement results, the error is small, the cell ratio of the expression level of 16sRNA of Mycobacterium tuberculosis and reference gene levels within the organization as a survivability evaluation index of bacteria. This index can be used to evaluate the severity of tuberculosis infection and the effect of clinical drug treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法
本专利技术属于结核分枝杆菌感染
，尤其涉及一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法。
技术介绍
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。临床上诊断结核的主要依据：标本切片、直接涂片镜检、集菌涂片、分离培养、X线检查、聚酶链反应(PCR)扩增技术直接涂片镜检法操作如下：材料：结核病人痰液、载玻片、酒精灯、接种环；抗酸染色液：石炭酸复红液、3％盐酸酒精溶液、吕氏美蓝溶液。1、涂片：(1)取病患清晨痰液；(2)取干酪样坏死或带血小块，涂成薄膜状；(3)自然干燥，外焰固定，染色；2、抗酸染色(1)初染：夹住涂片一端，持平，滴加石碳酸复红染液，使之完全覆盖标本，(或在已固定的结核分枝杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，)置酒精灯高处徐徐加热，待染液出现蒸汽时移开，蒸汽减少时再加热，反复操作3-5分钟。(2)待玻片冷却后，用水缓慢冲洗，用吸水纸吸干。(3)脱色：滴加3％盐酸酒精，轻晃玻片，直至无红色液体流下为止，一般作用1-3min，水洗，吸干。(4)复染：用碱性美兰溶液复染1min，用水冲洗后吸干。3、油镜观察－：仔细观察至少300视野未发现抗酸菌；±：300个视野内发现1-2个抗酸菌(全部涂膜镜检3遍)；+：100个视野内发现1-9个抗酸菌(全部涂膜镜检1遍)；2+：10个视野内发现1-9个抗酸菌；3+：每个视野内发现1-9个抗酸菌；4+：每个视野内发现9个以上的抗酸菌。集菌涂片法操作如下：I、沉淀集菌法：取痰液2-3ml，40g/lNaOH1-2倍量混匀。经103.43Pa高压灭菌20-25min(或煮30min)，3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；П、漂浮集菌法：取晨痰2-3ml放入100ml三角瓶内，加1-2倍量40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌20-25min(或煮30min)。冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10-15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15-20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。集菌涂片结果：按“发现抗酸染色阳性细菌”或“未发现抗酸染色阳性细菌”报告。现有方法检测结果误差比较大，结果不准确，容易出现假阴性问题。申请号为CN201010522800.1的中国专利申请公开了一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量RT-PCR检测方法。该申请包括如下步骤：结核分枝杆菌复合群特异性定量RT-PCR引物和探针设计；标准分子的构建；细菌样本RNA与DNA的共同提取；对同一份样本分别进行RT-PCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。如果将该专利应用到测定结核分枝杆菌存活率中，缺点是构建重组质粒过程复杂；该专利检测样品为痰液，但大多数患者痰液中不含有结核杆菌(结核杆菌检出率低)，因此以痰液作为检测样品实际应用意义不大；没有引入内参基因，因此不能很好的剔除人为操作带来的实验误差，其次也无法对结核菌的存活率及感染严重程度提供一个科学的量化指标。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法。所述测定方法用于衡量经结核分枝杆菌感染后，细胞/组织中结核分枝杆菌的存活率。本专利技术的技术方案如下：一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，所述测定方法包括以下步骤：步骤(1)收集结核分支杆菌感染后的细胞/组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总DNA和总RNA；步骤(2)将提取的总RNA进行反转录，得到总cDNA；步骤(3)采用结核分枝杆菌的cDNA引物和人的内参基因DNA引物分别对同一个体的总cDNA、总DNA进行Real-timeqPCR绝对定量得到结核分枝杆菌cDNA拷贝数，人的内参基因的DNA拷贝数；步骤(4)根据结核分枝杆菌cDNA拷贝数/人的内参基因的DNA拷贝数得到结核分枝杆菌的存活率。所述人的内参基因为β-actin或GAPDH。所述总cDNA采用Real-timeqPCR绝对定量时以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作为标准品；总DNA采用Real-timeqPCR绝对定量时以人内参基因β-actin的PCR产物作为标准品。所述结核分枝杆菌感染后的检测样本来源于肺外结核病人病灶组织或血液。所述Real-timeqPCR绝对定量方法如下：步骤(1)标准品的建立以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作为标准品，所述标准品碱基数已知，使用微量核酸蛋白测定仪检测标准品的cDNA浓度；以人的内参基因β-actin的PCR产物作为标准品，所述标准品碱基数已知，使用微量核酸蛋白测定仪检测标准品的DNA浓度；根据以下公式计算出结核分枝杆菌16sRNA标准品的cDNA拷贝数和人内参基因β-actin标准品的DNA拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝(浓度/相对分子质量)×6.02×1023×10-9；步骤(2)制作标准曲线对标准品进行10倍系列倍比稀释，至少选择5个稀释度，涵盖待测样本中目的基因可能出现的全部浓度范围；以系列稀释的标准品为模板进行Real-timeqPCR，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤(3)待测样品定量通过待测样品的Ct值和标准曲线公式，计算出待测样品中目的基因的拷贝数。所述结核分枝杆菌16sRNA基因序列扩增过程中的cDNA引物及探针如下：前引物tctcggattgacggtaggtg；后引物gcccagtaattccggacaac；探针cggtaatacgtagggtgcga。所述内参基因β-actin扩增过程中的DNA引物及探针如下：前引物actaacactggctcgtgtga；后引物cttgggatggggagtctgtt；探针catgaggctggtgtaaagcg。关于结核病，临床上一般通过对痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水标本进行诊断。由于取材比较方便，大部分现有临床检测方法都会选择痰液进行检测。本专利技术研究前期在检测结核病人的痰液过程中并没发现结核杆菌，检测结果呈现阴性(60份样本中绝大多数检测出来阴性)，但是在病理组织标本中检测出结核杆菌却是阳性，故如果只依靠结核病人的痰液检测结果，很容易在肺外结核病人检测中出现假阴性的问题，另外，现有方法的检测中只能定性分析是否感染结核杆菌，但是不能定量分析结核杆菌的感染程度。为解决上述问题，本专利技术在Real-time本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤：步骤(1)收集结核分枝杆菌感染后的细胞/组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总DNA和总RNA；步骤(2)将提取的总RNA进行反转录，得到总cDNA；步骤(3)采用结核分枝杆菌的cDNA引物和人的内参基因DNA引物分别对同一个体的总cDNA及总DNA进行Real‑time qPCR绝对定量得到结核分枝杆菌cDNA拷贝数，人的内参基因的DNA拷贝数；步骤(4)根据结核分枝杆菌cDNA拷贝数/人的内参基因的DNA拷贝数得到结核分枝杆菌的存活率。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤：步骤(1)收集结核分枝杆菌感染后的细胞/组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总DNA和总RNA；步骤(2)将提取的总RNA进行反转录，得到总cDNA；步骤(3)采用结核分枝杆菌的cDNA引物和人的内参基因DNA引物分别对同一个体的总cDNA及总DNA进行Real-timeqPCR绝对定量得到结核分枝杆菌cDNA拷贝数，人的内参基因的DNA拷贝数；步骤(4)根据结核分枝杆菌cDNA拷贝数/人的内参基因的DNA拷贝数得到结核分枝杆菌的存活率。2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述人的内参基因为β-actin或GAPDH。3.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述总cDNA采用Real-timeqPCR绝对定量时以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作为标准品；总DNA采用Real-timeqPCR绝对定量时以人内参基因β-actin的PCR产物作为标准品。4.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌感染后的检测样本来源于肺外结核病人病灶组织或血液。5.如权利要求1～4任一所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述Real-timeqPCR绝对定量方法如下：步骤(1)标准品的建立以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作...

【专利技术属性】
技术研发人员：宝福凯，柳爱华，陶律延，杨佳儒，麻明彪，韩欣霖，彭芸，白若兰，戴熙廷，赵华，沈龙强，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53