本发明专利技术涉及一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记及其应用，应用分子标记gm‑4辅助选育抗稻瘟病水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，gm‑4为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有516bp的条带，则表示该检测样品含抗稻瘟病基因Pigm。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。
【技术实现步骤摘要】
一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记及其应用
本专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记及其应用。
技术介绍
由子囊菌[Magnaporthegrisea(Hebert)Barr]引起的稻瘟病是世界范围内水稻生产上最严重的病害之一，病害可以发生在水稻的各个生长时期，严重时减产40％-50％，甚至颗粒无收，是全球粮食安全的限制因子之一。大量施用化学农药对环境造成污染，控制这个病害最经济有效的方法是发掘和利用新的广谱持久抗病资源进行选育广谱抗病新品种。稻瘟病抗性是典型的数量性状，受多基因控制，且易受环境影响。常规抗病育种中，抗病性鉴定结果不准确导致育种效率偏低。分子标记辅助选择是一种利用与抗性基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。Pigm是一个广谱抗稻瘟病基因，比公认的广谱抗性基因Pi1,Pi2,Pi3的抗谱更广；Pigm来源于四川地方品种谷梅4号，对收集自不同地区和国家的30个强致病菌株中的29个表现高抗或免疫，于2017年被成功克隆(Dengetal.,2017)，从机制上解释了Pigm介导的抗病具有持久性，利用Pigm改良选育的品种既有广谱持久抗病性又不影响最终的产量，在抗稻瘟病育种方面有很大的应用价值，开发Pigm基因的功能性标记对充分利用该基因，进一步改良水稻稻瘟病抗性有着重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记、其的正反引物及其应用。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案是：一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记，所述分子标记编号为gm-4，所述分子标记gm-4的正反引物序列为：gm-4F：5’-CTTGTCTCTCTCGCCCTCTCA-3’gm-4R：5’-AGGAGTCAGGACTTAGGGTTTCT-3’。本专利技术提供了分子标记gm-4的用途：所述分子标记gm-4用于水稻抗瘟病基因Pigm的鉴定和/或抗瘟病水稻的辅助选择育种。进一步的，所述用于水稻抗瘟病基因Pigm的鉴定包括以下实验步骤：i、提取供试水稻样品基因组；ii、利用所述分子标记gm-4的正反引物组合对步骤i中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；iii、通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，如果有515bp的单条带，则表示所述样品为Pigm基因纯合。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过利用核苷酸序列差异设计Pigm基因的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便，利用该标记进行抗稻瘟病水稻辅助选择能缩短育种周期，提高效率。附图说明下面结合附图对本专利技术的一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记及其应用作进一步说明。图1是本专利技术中分子gm-4标记对23个水稻品种的电泳检测图。注：1-23分别表示水稻品种1：旱恢3号，2：BL6，3：沪旱1B，4：B5，5：SAGC4，6：日本晴，7：黄华占，8：603B，9：0412，10：389B，11：R9，12：华15B，13：R15，14：沪旱9B，15：R37，16：沪旱11B，17：N632S，18：秀水123，19：R49，20：湘晴，21：沪旱7B、22：75-1-127，23：谷梅4号。M表示D2000Marker。具体实施方式实施例1：Pigm基因分子标记的开发(1)、供试材料。抗病水稻品种：谷梅4号。感病水稻品种：1：旱恢3号，2：BL6，3：沪旱1B，4：B5，5：SAGC4，6：日本晴，7：黄华占，8：603B，9：0412，10：389B，11：R9，12：华15B，13：R15，14：沪旱9B，15：R37，16：沪旱11B，17：N632S，18：秀水123，19：R49，20：湘晴，21：沪旱7B、22：75-1-127。(2)、水稻基因组DNA提取方法参考楼巧君(2006)中所述方法。(楼巧君,陈亮,罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种,2006,3(5):749-752)(3)、基因分子标记gm-4的开发：Pigm是一个已克隆的广谱抗稻瘟病基因，位于第6染色体，与Pi-9,Pi-z,Pi2等互为等位的关系，Pigm的全基因组序列来自GenBank数据库，收录号为KU904633.2，比对发现，谷梅4号中Pigm基因从第92245到93120个碱基的876bp片段在相应的参考基因组日本晴感病等位基因(DQ454158.1)中是缺失的(见表1)且此片段还可以与第12染色体(21574111bp-21573243bp)匹配，因此单独扩增此片段无法准确判断是否含有Pigm基因，因此在此片段前面设计一条正向引物，片段中间设计一条反向引物，在含有Pigm基因的抗病品种中能正反引物能配对扩增，而在不含Pigm基因的感病品种中无法匹配不能扩增。表1：日本晴与谷梅4号的部分碱基比较说明：*号标注出相同碱基，-号表示缺失碱基。(4)、根据核苷酸序列差异，利用PrimerPremier5.0软件设计引物gm-4，其正反引物序列为：gm-4F：5’-CTTGTCTCTCTCGCCCTCTCA-3’gm-4R：5’-AGGAGTCAGGACTTAGGGTTTCT-3’。实施例2：Pigm基因分子标记的亲本多态性检测(1)、提取供试水稻品种基因组，提取方法为常规CTAB法。供试水稻品种分别为：1：旱恢3号，2：BL6，3：沪旱1B，4：B5，5：SAGC4，6：日本晴，7：黄华占，8：603B，9：0412，10：389B，11：R9，12：华15B，13：R15，14：沪旱9B，15：R37，16：沪旱11B，17：N632S，18：秀水123，19：R49，20：湘晴，21：沪旱7B、22：75-1-127、23：谷梅4号沪旱1B、秀水123、沪旱7B、黄华占、中组14、沪旱11B、日本晴和75-1-127。(2)、利用功能标记gm-4对供试水稻品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10uLTaqPCRMastermix(天根生化科技(北京)有限公司)，10uM的前后引物各1uL，补充ddH2O至20uL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，58℃下30s，72℃下1min进行30个循环，最后72℃下延伸5min。(3)、取PCR产物8uL上样于2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，抗病水稻亲本谷梅4号扩增出516bp的单条带，在其他感病水稻品种中均无法扩增得到516bp的条带，电泳条带清晰，差异明显。实施例3：Pigm基因分子标记的验证与应用以携带Pigm基因的抗病亲本谷梅4号为供体，节水抗旱稻恢复系旱恢3号为受体，改良旱恢3号的稻瘟病抗性。旱恢3号/谷梅4号//旱恢3号的BC1F2代群体共384个单株种植于井冈山稻瘟病自然鉴定基地，首先利用Pigm基因功能标记gm-4对384个单株的基因组DNA进行PCR扩增，产物在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分型，检测到280个单株有516bp的条带，表示这些单株含有Pigm基因，剩余的104个单株没有扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为gm‑4，所述分子标记gm‑4的正反引物序列为：gm‑4 F：5’‑ CTTGTCTCTCTCGCCCTCTCA ‑3’gm‑4 R：5’‑ AGGAGTCAGGACTTAGGGTTTCT ‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为gm-4，所述分子标记gm-4的正反引物序列为：gm-4F：5’-CTTGTCTCTCTCGCCCTCTCA-3’gm-4R：5’-AGGAGTCAGGACTTAGGGTTTCT-3’。2.根据权利要求1所述水稻抗瘟病基因Pigm的分子标记，其特征在于：所述分子标记gm-4用于水稻抗瘟病基因Pigm的鉴定和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，刘国兰，孔德艳，唐金娟，张安宁，王飞名，毕俊国，余新桥，罗利军，
申请(专利权)人：上海市农业生物基因中心，
类型：发明
国别省市：上海,31
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