抗BTLA蛋白单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.12284)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab61。本发明专利技术还涉及单克隆抗体Umab61在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab61的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab61在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与BTLA蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了BTLA蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

Anti BTLA protein monoclonal antibody and uses thereof

The present invention relates to the field of biotechnology, discloses a hybridoma cell line (the preservation number is CGMCC No.12284), and the hybridoma cell lines producing monoclonal antibody Umab61. The invention also relates to monoclonal antibody Umab61 in preparation for the application of immune detection tool for the detection of BTLA protein in the immune group containing monoclonal antibody Umab61 kit, and the monoclonal antibody Umab61 kit used for preparing labeled tumor in. The monoclonal antibody of the invention can be specifically combined with BTLA protein, and has no cross reaction with other proteins in the cell, and remarkably improves the specificity, accuracy and reliability of BTLA protein immunological detection.

【技术实现步骤摘要】
抗BTLA蛋白单克隆抗体及其用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及可特异结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。
技术介绍
免疫细胞表面的辅助受体的激活对机体免疫的调节起到非常重要的作用，其中CD28/B7配体受体家族成员研究的比较多，如：CTLA4，PD1和B、T淋巴细胞衰减因子(BandTlymphocyteattenuator,BTLA)等。他们都起到了负向调节免疫应答的作用。BTLA又名CD272，是最近才被发现的CD28家族的一员，属于Ig超家族成员。主要表达在激活后的B、T淋巴细胞表面。同PD-1一样，BTLA的胞内区域也有一个免疫受体Tyr抑制基序，通过和配体HVEM结合后能抑制T细胞的活化。因而在肿瘤浸润的淋巴细胞中，BTLA的表达量可反映免疫抑制的状态。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对BTLA蛋白的单克隆抗体对IHC检测BTLA表达水平具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种结合特异性较高的BTLA蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用。本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2016年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.12284。本专利技术还提供了一种特异性结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61，由上述杂交瘤细胞株产生。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：根据BTLAORF核苷酸序列(BTLAORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，870bp；BTLA氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物PCR扩增BTLAORF第1bp位到第867bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建BTLA氨基酸序列第1位到第289位的重组表达质粒pCMV6-rBTLA；上游扩增引物序列，SEQIDNO.3:CACGCGATCGCATGAAGACATTGCCTGCCATG下游扩增引物序列SEQIDNO.4:ACCGACGCGTACTCCTCACACATATGGATGCA(2)BTLA重组蛋白的表达与纯化：将BTLA重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的BTLA重组蛋白；(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的BTLA重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗BTLA特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为Umab61，亚型鉴定为IgG2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得BTLA单克隆抗体Umab61。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。本专利技术将所述单克隆抗体Umab61与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本专利技术所述单克隆抗体Umab61特异性结合BTLA蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。本专利技术还提供了单克隆抗体Umab61在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本专利技术提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体Umab61，可检测组织细胞中BTLA的表达状况。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与BTLA的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌。与现有技术相比，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.12284)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab61。本专利技术还提供了单克隆抗体Umab61在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab61的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab61在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本专利技术所述单克隆抗体可与BTLA蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了BTLA蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤浸润淋巴细胞内BTLA蛋白表达水平，可应用于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤免疫微环境的检测。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株Umab61的分类命名为：鼠抗人B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)单克隆杂交瘤细胞株；保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年4月27日；保藏编号：CGMCCNo.12284。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；图2示实施例2重组BTLA蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK检测重组BTLA蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pCMV6-rBTLA质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；图3示实施例2重组BTLA蛋白SDS-PAGE结果图，用抗DDK亲和层析柱纯化重组BTLA蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；图4示实施例3以单克隆抗体Umab61识别完整的BTLA(FulllengthBTLA,BTLA-FL)蛋白的Westernblot检测结果图。泳道1为转染pCMV6-Entry的细胞裂解液；泳道2为转染pCMV6-BTLA-FL的细胞裂解液；图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌免疫组化结果图(一抗为BTLA单克隆抗体Umab61)；图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肺癌免疫组化结果图(一抗为BTLA单克隆抗体Umab61)；图7示实施例5OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为BTLA单抗Umab61，1:100；二抗为DyLight649-conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61，由保藏编号为CGMCC No.12284的杂交瘤细胞株产生。

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合BTLA蛋白的单克隆抗体Umab61，由保藏编号为CGMCCNo.12284的杂交瘤细胞株产生。2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.12284。3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测BTLA蛋白的免疫检测工具中的应用。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东晖，魏海涛，陈才伟，褚伯阳，袁克湖，王宜，王广力，舒又敏，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32