一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体制造技术
【技术实现步骤摘要】
一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体
本专利技术涉及基因工程
，具体的讲是一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体。
技术介绍
非霍奇金淋巴(non-Hodgkinlymphoma，NHL)是临床中常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，非霍奇金淋巴瘤是一种常见的B细胞型淋巴瘤。随着NHL发病的逐年增加，化疗药物是治疗NHL的最主要的方式。虽然，放化疗药物对有效控制患者病情、延长缓解期具有重要意义。然而，在对患者进行放化疗时，不但可以杀伤肿瘤细胞，同时也会对人体内的正常细胞产生一定的杀伤作用，继而不同程度的影响患者消化功能、骨髓功能，同时还会产生血小板及白细胞减少、掉发脱发、胃口缺乏、恶心呕吐等一系列的不良反应，致使患者的生活质量水平降低、甚至有的患者因为不能忍受化疗带来的痛苦而停止进行化疗。现代医疗技术中的放化疗技术已经不能满足人类迫切治疗该类疾病的渴求，而具有靶向治疗机制的单克隆抗体方法开始被人们广泛研究和应用。近几年，对NHL的靶向性治疗以及单克隆抗体药物的临床研究取得了较大的突破，可以被人们接受使用的便是抗CD20单克隆抗体药物，并且它的临床治疗效果得到了广泛的认可。CD20分子在B淋巴细胞表面特异性表达，是分子量大小为34-36kDa的膜蛋白，由297个氨基酸组成，在细胞表面以非糖基化的形式呈现。CD20分子包含4个跨膜区，其中羧基端与氨基端都在胞质内侧，而第三跨膜区与第四跨膜区间的含有43个氨基酸的环区，构成了CD20分子的抗原表位。临床NHL85％为B细胞型淋巴瘤，CD20分子在大多数成熟和恶性B细胞表面表达。并且CD20分子对抗体来说容易接近...
【技术保护点】
一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列或优化的CD20H、CD20L编码的氨基酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，优化的CD20H核苷酸序列为SEQ ID NO：1，优化的CD20L核苷酸序列为SEQ ID NO：2，优化的CD20H编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，优化的CD20L编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
【技术特征摘要】
1.一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括优化的CD20H、CD20L核苷酸序列或优化的CD20H、CD20L编码的氨基酸序列，其中，CD20H为CD20重链可变区与恒定区Fc序列连接得到，CD20L为CD20轻链可变区与恒定区Fc序列连接得到；将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上HindIII酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，优化的CD20H核苷酸序列为SEQIDNO：1，优化的CD20L核苷酸序列为SEQIDNO：2，优化的CD20H编码的氨基酸序列为SEQIDNO：3，优化的CD20L编码的氨基酸序列为SEQIDNO：4。2.根据权利要求1所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体的制备方法包括如下制备步骤：1)将CD20抗体轻、重链可变区与恒定区Fc序列连接，即得到高亲和力的人源化CD20抗体的全长氨基酸序列，分别命名为CD20L、CD20H；2)将CD20H、CD20L核苷酸序列分别通过CHO细胞偏爱密码子进行优化，在N末端添加真核表达原件Kozak序列、信号肽序列和起始密码子ATG，并在5’端加上HindIII酶切位点，3’端加上EcoRI位点得到优化的CD20H、CD20L核苷酸序列，其中，CD20H的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGGATTCA-3’、5’-CGGGAATTCCTATTATTTACCGGGAGACA-3’，分别命名为FL-HF、FL-HR，CD20L的引物为5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGATTTTCAAGTG-3’、5’-CGGGAATTCCTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’，分别命名为FL-LF、FL-LR；3)将优化的CD20H、CD20L核苷酸序列及质粒载体PCDNA3.1、PCDNA3.1/ZEO经HindIII、EcoRI双酶切，把酶切后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收，回收后得到目的基因与载体；4)将目的基因与载体在22℃条件下用T4DNA连接酶连接2h，经T4DNA连接酶连接后得表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L；5)把连接后得到的表达载体PCDNA3.1-CD20H、PCDNA3.1/ZEO-CD20L分别转化到感受态细胞DH5α中；6)利用氨苄西林(Amp)抗性筛选阳性克隆；7)利用抽屉试剂盒对质粒进行抽提；8)CHOk1细胞的转染与单克隆细胞的筛选。3.根据权利要求2所述的一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体，其特征在于，所述步骤2)中CD20H的信号肽序列为ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC，CD20L的信号肽序列为ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCAT...
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