一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明专利技术成功构建含有目的基因的重组菌株E. coli BL21(DE3)/pET‑GDH(A258F)。重组菌E. coli BL21(DE3)/pET‑GDH(A258F)诱导表达出突变酶A258F，粗酶液经His‑Trap亲和层析纯化后得到纯酶A258F。通过优化酶活测定条件，A258F在pH7.0的磷酸钾缓冲液中于55℃中比酶活高达7.59U·mg

【技术实现步骤摘要】
一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体
本专利技术涉及一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体，属于基因工程

技术介绍
葡萄糖脱氢酶能以NAD(P)+作为辅因子催化葡萄糖生成葡萄糖酸-1,5-内酯，它在工业上被广泛用于血糖测定的检测试剂盒和生物传感器。此外，在氧化还原酶催化的不对称还原反应中葡萄糖脱氢酶被广泛用于辅酶循环，如(R)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶偶联后高效催化2-羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇。目前，葡萄糖制备的主要原料有玉米，甘薯。但是粮食作物生产成本高，为了节约粮食，也为了实现我国的可持续发展，利用可再生的木质纤维素资源进行生化药剂的生产逐渐引起社会的关注。纤维素类物质主要包括纤维素，半纤维素和木质素三种成分。将半纤维素酸解或酶解后可获得90％的D-木糖，然而工业生产中的微生物不能有效地利用木糖。因此，高效利用木糖是利用植物纤维素类资源解决人类资源、环境之间的矛盾，实现可持续发展的关键之一。基于这些前提，筛选新的酶或者通过理性设计改造现有的氧化还原酶使其可以高效催化木糖就显得十分必要。葡萄糖脱氢酶是短链脱氢酶家族的一员。目前短链脱氢酶家族包括47000多条基因和蛋白序列，其中有超过300个蛋白质结构已经被解析并储存在PDB数据库中。虽然大多数短链脱氢酶的序列相似性只有20％-30％，但是它们共享相似的三维立体结构。短链脱氢酶家族的结构包括一个与辅酶NAD(P)+结合的罗斯曼折叠和一个由Ser-Tyr-Lys组成的活性催化三角，这些结构信息都有助于对其进行理性改造以改变酶的催化功能。专利技术人之前筛选到一种来自Bacillussp.YX-1的具有良好有机溶剂耐受性的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)，它在不对称反应中常以葡萄糖作为底物进行辅酶的循环再生。但是其催化木糖的比酶活还有待提高。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术基于同源序列比对和蛋白结构分析在BsGDH底物结合域附近设计定点突变，提高BsGDH对木糖的酶活力。本专利技术的突变酶A258F对木糖的酶活力相较于野生型提高了4倍，可利用木糖作为辅助底物进行不对称转化反应中的辅酶循环，从而实现了对木糖的有效利用。本专利技术方法解决了木糖资源不能有效利用的问题，有助于对丰富、廉价的植物纤维素类资源的合理利用，促进经济的可持续发展。本专利技术的目的是提供一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是：(1)在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上将第258位的氨基酸进行突变；或者，(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述将第258位的氨基酸进行突变，是突变成苯丙氨酸(A258F)、组氨酸(A258H)、色氨酸(A258W)或者酪氨酸(A258Y)。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸片段。本专利技术的第三个目的是提供含有编码所述突变体的基因的载体。在一种实施方式中，所述载体为pET载体或者PMD19-T载体。本专利技术的第四个目的是提供一种能利用木糖的重组菌，所述重组菌表达本专利技术的葡萄糖脱氢酶突变体。在一种实施方式中，所述重组菌可以是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母为宿主构建得到的。在一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主构建得到的。在一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主、pET-28a为载体构建得到的。本专利技术的第五个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸片段、含有编码所述突变体的基因的载体、表达所述突变体的基因工程菌(尤其是大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌)在食品、化工或纺织领域的应用。在一种实施方式中，所述应用是用于催化木糖。本专利技术的突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如A258F，表示位置258的氨基酸由亲本葡萄糖脱氢酶的丙氨酸Ala替换成苯丙氨酸Phe，位置的编号对应于亲本葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列的相应位点。本专利技术的优点和效果：本专利技术成功构建含有目的基因的重组菌株BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-GDH(A258F)诱导表达出突变酶A258F，粗酶液经His-Trap亲和层析柱纯化后得到纯酶A258F。通过优化酶活测定条件，A258F在pH7.0的磷酸钾缓冲液中于55℃中有高达7.59U·mg-1的比酶活。这些工作为葡萄糖脱氢酶用于不对称转化反应的辅酶循环提供了新的底物，解决了木糖资源不能有效利用的问题，有助于降低生产成本，为工业中木糖利用提供了优良菌种，为基因工程法改造酶的底物特异性奠定了基础。具体实施方案下面是对本专利技术进行具体描述。实施例1：表达突变体A258F的重组菌的构建一、质粒pET-GDH的获得重组E.coliBL21(DE3)/pET-GDH的培养基组成为：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％。将重组菌接种于培养基装液量为5mL试管中于37℃、200rpm振荡培养8h。培养结束后，将菌体于12,000rpm下离心1min并收集细胞，利用质粒提取试剂盒Mini-PlasmidRapidIsolationKit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET-GDH；其中质粒pET-GDH中的葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示(核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)。二、重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-GDH(A258F)的构建(1)A258F全长基因的获得：合成两端引物(序列分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示)：A258F-f：5’-CGGCTAGCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCG-3’(NheI)，A258F-r：5’-CCTCGAGTTAACCGCGGCCAAACTGGAATGACG-3’(XhoI)。采用PCR的方法，将突变引入，具体方法如下：PCR反应体系：ddH2O22μL，PremixPrimeSTAR25μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，质粒DNA1μL。PCR反应：98℃预变性30s；98℃10s，60℃15s，72℃60s，进行30个循环；72℃延伸10min。以pET-GDH为模板，以引物A258F-f和A258F-r进行PCR反应，获得突变的全长基因。利用3SSpinAgaroseGelDNAPurificationKit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。纯化后的基因PCR产物与pMD19-T载体通过TA互补连接，连接产物转化大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，重组质粒T-GDH(A258F)用双酶切、PCR及上海生工测序进行验证。(2)重组质粒pET-GDH(A258F)的获得：基因GDH(A258F)及pET-28a的酶切：利用质粒提取试剂盒Mini-PlasmidRapidIsolationKit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒T-GDH(A258F)和pET-28a。按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是：(1)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上将第258位的氨基酸进行突变；或者，(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是：(1)在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上将第258位的氨基酸进行突变；或者，(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的序列。3.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述将第258位的氨基酸进行突变，是突变成苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸或者酪氨酸。4.编码权利要求1～2任一所述突变体的核苷酸片段。5.含有编码权利要求1～2任一所述突变体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣珍，徐岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32