诊断用己糖激酶的制备方法技术

本发明专利技术属于酶制剂的生产，特别是指一种诊断用己糖激酶的制备方法。包括菌种的纯化及复壮、发酵制备含有己糖激酶的发酵液、对发酵制备的己糖激酶粗酶液进行纯化等工艺步骤，本发明专利技术解决了目前国内尚无自主知识产权的诊断用己糖激酶出售、进口酶制剂价格偏高且使用不便等问题，具有菌种来源及制备方法可行且适于工业化生产、填补了国内尚无自主知识产权诊断用己糖激酶产品的空白、所制备的产品主要性能指标高于进口产品等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶制剂的生产，特别是指一种诊断用己糖激酶的制备方法。
技术介绍
己糖激酶(Hexokinase)是以己糖为特异性底物的六碳糖磷酸化酶，在生物体的糖酵解过程中起重要作用。己糖激酶是一种别构酶，催化葡萄糖从稳定状态变为活跃状态，其Km值小，对底物亲和性强，专一性不强，可针对多种六碳糖进行作用。利用其作用原理和特点，该酶主要用于临床诊断试剂。随着生活水平的提高，糖尿病患者的数量也在急剧上升。目前血液中葡萄糖在临床上检测方法有两种，分别是葡萄糖氧化酶(GOD)法和己糖激酶(HK)法。GOD法作用特点是葡萄糖氧化酶酶的专一性强，作用底物专一，但干扰因素较多，尤以作用于α-D-葡萄糖能力很弱，配成成品试剂盒测定时间较长，均在10分钟以上。HK法因具有己糖激酶专一性不强、干扰因素较少、作用于α-D-葡萄糖能力很强、Km值很小、对底物亲和力很强、配成成品试剂盒测定时间短、反应均在10分钟内完成、测定线性范围宽(2-750mg/dL)等特点，尤其适用于全自动分析仪，为此己糖激酶法被临床检验界公认是检测血糖和尿糖的参考方法。基于两种检测方法各具优势，目前市场占有率约各占50％。就申请人了解的范围而言，未检索到关于己糖激酶的相关标准或规范。申请人检索到的相关专利文献包括：专利号为5948665、名称为HexokinaseobtainedfromthermophilicyeastKluyveromycesfragilis的美国专利中公开了一种己糖激酶，该酶是从嗜热酵母中分离菌株后发酵得到，具有耐高温特性，其酶活为59U/g(g为细胞湿重)，耐热温度为37℃。由于该己糖激酶耐热性较其他己糖激酶产品高，解决了试剂盒使用过程中因温度限制带来的不宜长时间储存的问题,延长试剂盒的使用时间。但其酶活力不是很高，且在实际使用过程中，耐受温度还有一定的局限性。专利号为201510554930.6的文献中公开了一种血清葡萄糖检测试剂，是利用己糖激酶配制出较为稳定的己糖激酶法血糖试剂盒来检测血清中葡萄糖的含量，不涉及己糖激酶的制备。专利号为201610126969.2的文献中公开了一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒，提供了一种稳定的酶法血清镁离子检测试剂盒，己糖激酶是构成试剂盒的一种组成成分，也不涉及己糖激酶的制备。申请人未在其他专利中查阅到相关己糖激酶的制备研究。目前国内对己糖激酶的研究主要集中在植物体代谢途径和人体肿瘤上，而诊断用己糖激酶因应用局限性大、市场需求量小等因素导致国内关于其工业化生产的研究进展缓慢，就申请人了解的范围而言目前未见有自主知识产权的诊断用己糖激酶产品。市售己糖激酶试剂盒的原料HK均源于进口，国内尚无自主知识产权的诊断用HK制剂出售。而进口酶因价格昂贵、进口途径复杂、遇质量问题难以解决等原因，给试剂盒生产厂家带来诸多不便。为采用国产试剂级己糖激酶试剂替代进口产品，普及HK法血糖测试盒在临床中的应用，以满足临床对高精度检验的需要，为医生诊断疾病提供可靠的数字依据。筛选产己糖激酶的微生物菌株，对其进行发酵、提取和纯化获得诊断用己糖激酶，从而替代进口产品，不仅是国内市场亟待填补的产品空白，同时也是本领域技术人员的主要研发方向和所面临的技术难题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种诊断用己糖激酶的制备方法，所制备的诊断用己糖激酶具有比活力、酶活及纯度较高。本专利技术的整体技术构思是：诊断用己糖激酶的制备方法，包括如下工艺步骤：A、菌种的纯化及复壮A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30-35℃恒温培养2-3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32-37℃继续培养，挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测。最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株；将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28-30℃条件下培养12-16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；A2、纯化及复壮后菌种的保藏按质量比为1：1-3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％-50％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液；发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液；D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。其中步骤的活化的主要目的是为保证低温保藏下的菌种尽快恢复活性以应用于工业生产，因其属于本
普通技术人员的应知应会内容，申请人在此对其工艺步骤及工艺条件不再赘述。本专利技术的具体技术构思还有：发酵主要目的是便于在发酵过程中合成己糖激酶，同时满足工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的步骤B包括如下工序：B1、摇瓶种子的制备将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃-30℃，转速为180-220rpm的条件下培养12-16小时制成摇瓶种子液；摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；摇瓶装液量为15％-25％；B2、发酵罐发酵将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵36-40小时制成含有己糖激酶的发酵液；发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；发酵罐装量为60％-70％。对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液的主要目的是便于从发酵液中提取己糖激酶，因其主要包含与菌体细胞内，为获得更好的提取效果，优选的步骤C的工艺步骤如下：将步骤B2制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体，将收集到的菌体溶解于pH＝7.6、浓度为40-50mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁，将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。对己糖激酶粗酶液进行纯化的主要目的是去除己糖激酶粗酶液中的杂质，以满足临床诊断的需要，结合己糖激酶及粗酶液中所含有杂质的特点，优选的技术方案是，所述的步骤D包括如下工艺步骤：D1、将步骤C制备的己糖激酶粗酶液经过中空纤维超滤滤除小分子杂质；D2、利用阴离子交换柱对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化，包括如下步骤：D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4-5个柱体积后进行样品上样，流速为1-2mL/min；D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3-4个柱体积，使未与填料结合的杂蛋白完全去除；D2-3、用含有浓度为0-0.5mol/本文档来自技高网...

【技术保护点】
诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、菌种的纯化及复壮A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30‑35℃恒温培养2‑3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32‑37℃继续培养，挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测，最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株；将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28‑30℃条件下培养12‑16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％‑3％；酵母粉0.5％‑1.5％；葡萄糖1％‑3％；余量为水；pH＝6.5‑7.5；酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；A2、纯化及复壮后菌种的保藏按质量比为1：1‑3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％‑50％的无菌甘油溶液中于‑20℃保藏；B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃‑30℃、压力为0.03MPa‑0.05MPa、搅拌转速为150rpm‑200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液；发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％‑3％；酵母粉0.5％‑1.5％；葡萄糖1％‑3％，余量为水；pH＝6.5‑7.5；C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液；D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。...

【技术特征摘要】
1.诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、菌种的纯化及复壮A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上，于30-35℃恒温培养2-3天，选取长势良好的单菌落划线培养，于32-37℃继续培养，挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测，最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株；将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中，在温度为28-30℃条件下培养12-16小时，试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产，产品标准代码为GB/T20886；A2、纯化及复壮后菌种的保藏按质量比为1：1-3的比例，将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30％-50％的无菌甘油溶液中于-20℃保藏；B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液；发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液；D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。2.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法，其特征在于所述的步骤B包括如下工序：B1、摇瓶种子的制备将步骤A2中保存的菌种活化后，按质量百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中，在温度为28℃-30℃，转速为180-220rpm的条件下培养12-16小时制成摇瓶种子液；摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％；余量为水；pH＝6.5-7.5；摇瓶装液量为15％-25％；B2、发酵罐发酵将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1％-4％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中，在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵36-40小时制成含有己糖激酶的发酵液；发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成：蛋白胨1％-3％；酵母粉0.5％-1.5％；葡萄糖1％-3％，余量为水；pH＝6.5-7.5；发酵罐装量为60％-70％。3.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春卯，罗同阳，孙国龙，郑翔，吴芳彤，杨何宝，曹倩荣，秦艳梅，马清河，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13