一种抗CD20特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明专利技术还公开了上述抗CD20特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于CD20基因表达相关肿瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞免疫
，尤其涉及一种抗CD20特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
B淋巴细胞肿瘤是起源于B细胞的恶性血液系统疾病，主要包括：B细胞源行的急性淋巴系统白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)及大部分的慢性淋巴系统白血病(CLL)。其中ALL的发病率最高，并且有逐年增高的趋势。目前的治疗主要通过全身化疗和造血干细胞的移植。大剂量的放化疗，毒副作用强，患者耐受性差，免疫力大大降低，虽然可以缓解，但是复发率高。而且造血干细胞的来源稀缺，配型成功率低。嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor；CAR-T)治疗是利用基因工程技术，借助逆转录病毒或者慢病毒载体或者mRNA转导，使得T细胞获得可以识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤的嵌合抗原受体。CAR-T治疗相比于传统的治疗方法展现出巨大的优势，具体体现在杀伤肿瘤精准性高，CAR-T细胞治疗采用抗原抗体特异性结合的技术，只有肿瘤表面抗原表达的肿瘤细胞被杀伤，对正常细胞的伤害小；杀伤肿瘤范围广泛，只要表达肿瘤相关抗原，CAR-T细胞就能清除，对于转移性肿瘤复发性肿瘤均有效；对于患者而言避免了放化疗的痛苦，恢复健康迅速。CD20是一种磷酸化蛋白质分子，分子质量约为35kD，属于4次跨膜的蛋白质超家族，为B淋巴细胞表面特有的分化抗原，其可能参与B细胞的增殖、分化、信号转导和钙离子的跨膜传递。CD20分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征，它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞CD20特异性的表达于B淋巴细胞的表面，并且各个阶段的B细胞的表面均有表达。CD20表达于95％以上的B细胞肿瘤，包括NHL和CLL。因此CD20成为治疗血液系统肿瘤最具有潜力的靶点。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种抗CD20特异性嵌合抗原受体。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。为了实现上述目的，本专利技术提出的一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述人抗CD20单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。优选地，所述人抗CD20单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。优选地，所述人抗CD20单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。优选地，所述人抗CD20单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。优选地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。优选地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。优选地，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本专利技术还提出的上述抗CD20特异性嵌合抗原受体在制备治疗CD20相关肿瘤药物中的应用。其中，CD20表达于95％以上的B细胞肿瘤，包括NHL和CLL等等。本专利技术根据实验室从全人源抗体库筛选出CD20抗体Fab，经过密码子优化，基因合成抗CD20的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ中，即构建成CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，即获得本专利技术的嵌合抗原受体CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。利用嵌合抗原受体与慢病毒包装质粒RD114在GP2-293T细胞包装成N慢病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-T细胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及通过流式检测对CD20阳性的癌细胞的杀伤作用。本专利技术公布抗CD20特异性的嵌合抗原受体的结构，体外感染T淋巴细胞，修饰后的T淋巴细胞释放IFN-γ等杀伤肿瘤细胞。抗CD20特异性的嵌合抗原受体可以用于CD20基因表达相关肿瘤的靶向治疗。附图说明图1为本专利技术实施例1所得CD20scFv目的片段的电泳图，其中M为标准标记物，scFv为Her2-scFv目的片段。图2为本专利技术实施例1所得CD8TM-CD137-CD3ζ目的片段的电泳图，其中M为标准标记物。图3为本专利技术实施例2中采用Western Blotting检测本专利技术所得抗CD20特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达。图4为Western Blotting检测不同的对数生长期肿瘤细胞中CD20的表达。图5为本专利技术所得抗CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤检测。图6为本专利技术所得抗CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞在受到CD20抗原刺激后IFN-γ的表达。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1：抗CD20特异性嵌合抗原受体慢病毒载体的构建1.利用本实验室筛选的抗CD20的Fab序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，采用金斯瑞生物技术公司OptimumGeneTM基因设计软件对密码子进行进一步优化，在优化的序列两端分别加上NcoI、BamHI酶切位点，优化后的序列由南京金斯瑞生物技术公司完成基因合成，合成后的序列克隆在pUC57载体，质粒命名为CD20-scFv-pUC57。2.CD20-scFv-pUC57用限制性内切酶NcoI和BamH I酶切，酶切体系如下：2μg CD20-scFv-pUC57、1μL NcoI、1μL BamH I、2μL 10×酶切缓冲液，用水补到20μL，37℃水浴中过夜，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收目的片段；其结果如图1所示，pUC57-CD20-ScFv载体经NcoI和BamH I酶切释放目的条带。用同样的方法NcoI和BamH I酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体，用琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。其结果如图2所示，pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体经NcoI和BamH I酶切释放目的条带。将回收后的CD20-ScFv与酶切载体通过T4DNA连接酶连接，反应体系如下：2μL CD20-ScFv、2μL载体酶切产物、1μL 10×连接缓冲液、1μL连接酶，用水补到10μL，16℃水浴中过夜。取连接产物加入到DH5TM感受态中[参考《分子克隆》第三版中大肠杆菌感受态制备(CaCl2法)]，放置37℃细菌培养箱中过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序，将正确的载体命名为CD20-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。实施例2：抗CD20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗CD20单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。2.根据权利要求1所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1-3任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD20单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，所述人抗CD20单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.根据权利要求1-4任一项所述抗CD20特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗CD20单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。6.根据权利要求1-5任一项所述抗CD2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，唐小军，许国贞，刘振云，朱进，唐奇，陈渊，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34