本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白CFP10‑38kD‑19kD，并将其应用于肺结核的临床诊断。选用结核分枝杆菌的三个强抗原表位，利用PCR方法，以H37RV为模板构建的一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白，利用DNA‑水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达融合蛋白，利用金属螯合亲和层析技术对得到的重组蛋白进行纯化，最后以其为抗原，利用斑点金免疫渗滤技术制备新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒。与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、敏感性高等优点，为结核病的筛查和诊断提供更可靠的工具，亦可用于制备蛋白芯片、疫苗、单抗和多抗等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白的构建及其应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌感染所致的一种慢性传染病，以肺结核（Tuberculosis, TB）最为常见，呈世界性分布，是当今世界由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，严重威胁人类健康。据统计，全世界每年的新增病例约800万，死亡人数达200-300万。全球结核病负担最终的是亚洲和非洲，我国属于世界结核病高负担国家之一，位居世界第2位，全国接近有50 %的人感染过结核病，年发病人数约100万，每年死于结核病的人数达13万。其中只有少部分患者够得到正规的诊断，多数结核病患者因缺乏有效的检查而造成误诊和漏诊，延误治疗。由于结核病主要通过飞沫传播，因此结核病的早期诊断非常重要，采用简单、快速、准确的检查尽早对结核病做出诊断对结核病疫情的控制至关重要。目前常见的结核分枝杆菌检测方法主要包括细菌学、免疫学、分子生物学和最近发展的细胞生物学四大块，其中细菌学中的痰涂片法是临床最常用的检测方法之一，也是是临床诊断和鉴别结核病的“金标准”，是发现肺结核传染源的直接手段，但缺点为检出率较低，而痰培养耗时时间太长，需要1个月以上，很可能会延误TB的最佳治疗时间，延长感染传染期，远不能满足临床需要。因此，迫切需要寻找新的、快速、特异的检测方法以弥补传统方法的不足，从而有效控制结核分枝杆菌的传播。血清学检测是指在体外进行的抗原抗体反应，即利用已知的抗原来检查血清或其它样品如卵黄、牛奶中是否含有相应的抗体。目前已有关于TB抗原血清学技术诊断方法，具有操作简单、快捷、所需耗材少等优点，在TB快速筛查和诊断中具有明显的技术优势，应用前景较好，因此寻找理想的靶抗原，一直是众多学者研究的热点。然而，近年研究表明，单一的结核杆菌抗原在血清学诊断中的敏感性及特异性往往不够，难以有效区分结核杆菌感染人群及患病人群，因此国内外学者尝试将单一抗原联合应用到结核病患者血清抗体检测中。CFP10的编码基因位于RD1区，是重要的T细胞抗原，具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是结核病诊断和预防的研究热点；38kD是结核杆菌蛋白抗原之一，有研究证实，38kD抗原的免疫活性最强，缺乏抗38kD蛋白抗体的血清很难与结核菌其它抗原发生反应；19kD是结核杆菌细胞壁上的一种脂蛋白，其已经被证明是具有免疫原性的的抗原，可以被TB患者血清中的抗体所识别，一直以来被广泛研究，Lyashchenko等的研究表明，19kD作为抗原诊断结核病可以增加检测的灵敏度。目前国内外关于19kD融合蛋白的报道较少，因此本研究以CFP10、38kD、19kD在结核病血清学检测方面的优势，利用基因工程技术构建了CFP10-38kD-19kD三联融合蛋白，同时结合斑点金免疫渗滤技术制备了血清学检测试剂盒，期望能为结核病感染的诊断提供更为特异、准确的工具。
技术实现思路
（一）要解决的技术问题本专利技术目的是构建结核分枝杆菌CFP10-38kD-19kD三联重组融合蛋白，利用斑点金免疫渗滤技术（DIGFA）生产特异性高、假阳性低的新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒，为结核病提供一种可靠、方便、快速的临床诊断方法。（二）技术方案本专利技术根据NCBI数据库检索得到结核杆菌H37Rv标准菌株CFP10、38kD以及19kD基因序列，设计合成引物，经PCR、TA克隆后，酶切纯化3段基因片段，与pET28a载体进行依次重组，首先构建pET28a-CFP10重组质粒，鉴定成功基础上继续酶切与38kD片段连接，鉴定成功后，进一步酶切与19kD片段连接，酶切鉴定，最终获得pET-28a-CFP10-38kD-19kD重组表达载体，测序鉴定CFP10-38kD-19kD重组融合序列重组成功。本专利技术应用DNA-水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达重组融合蛋白。首先合成X-DNA，应用Apa I酶切对融合蛋白质粒进行线性化，同无核酸酶水、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液等组成DNA凝胶反应混合液；然后基于磁力搅拌方式制备DNA凝胶微颗粒，并对其进行纯化和鉴定；最后按照RTS 100 E.coli试剂盒制备商业化无细胞反应液，确定无细胞反应的最佳孵育时间、X-DNA以及基因模版的最适浓度。最终获得一种表达结核分枝杆菌CFP10-38kD-19kD三联重组融合蛋白的DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统。本专利技术应用金属螯合亲和层析介质技术（metal chelate chromatography）纯化上述步骤中得到的重组融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行氨基酸序列测定，同时应用BCA法测定融合蛋白浓度，应用ELISA法测定融合蛋白活性。最终获得纯度大于96 %的结核分枝杆菌CFP10-38kD-19kD三联融合蛋白。本专利技术将上述获得的高纯度重组融合蛋白包被在硝酸纤维素膜上，用胶体金标记葡萄球菌A蛋白（SPA），然后组装渗滤装置，建立并优化斑点金免疫渗滤检测体系，最终获得基于斑点金免疫渗滤技术的新型结核分枝杆菌血清学诊断试剂盒。临床血清样本检测实验表明，该试剂盒的敏感性为（96.8 %），假阳性为（2.8 %）。（三）有效效益采用本专利技术提供的结核分枝杆菌CFP10-38kD-19kD重组融合蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，更好的满足了结核分枝杆菌感染临床诊断的需要。附图说明图1是表达载体pET-CFP10-38kD-19kD的构建流程图；图2是表达载体pET-CFP10-38kD-19kD的酶切电泳图，A：单基因酶切电泳图，1：Marker ，2：CFP10，3：38kD，4：19kD；B：融合基因酶切电泳图，1：Marker，2：酶切前的重组质粒，3：CFP10，4：CFP10+38kD，5：CFP10+38kD+19kD；图3是X-DNA的4条寡核苷酸序列及检验电泳图，1：X1，2：X1+X2，3：X1+X2+X3，4：X1+X2+X3+X4；图4是DNA-水凝胶蛋白表达系统表达蛋白的金属螯合层析亲和纯化凝胶电泳图，1：Marker，2：纯化前，3：纯化后。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1：结核分枝杆菌CFP10-38kD-19kD重组融合蛋白的制备及纯化1.1 基因融合通过计算机分析TB H37Rv基因组全序列，选择其强抗原表位CFP10（GENEBANK locus：NP_218391）、38kD蛋白（GENEBANK locus：HG813240）和19kD（GENEBANK locus：CP007027）的DNA序列为模板，设计扩增引物为：CFP10扩增引物：CFP10-38-19a：GGAAGGCATATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTCFP10-38-19b：TTATTAGGATCCTCCGCCACCGAAGCCCATTTGCGA38kD扩增引物：CFP10-38-19e：GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACCFP10-38-19f：GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTCGCGATC19kD扩增引物：CFP10-38-19c：AATAGAATTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码结核分枝杆菌三联重组融合蛋白CFP10‑38kD‑19kD的融合基因，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码结核分枝杆菌三联重组融合蛋白CFP10-38kD-19kD的融合基因，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白CFP10-38kD-19kD，其特征在于：它是由权利要求1中的融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于：它是将权利要求1中的融合基因按照图1所示的构建方式连接到pET28a载体上，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统，其特征在于：它是以由四条寡核苷酸序列退火结合而成的X-DNA为骨架的水凝胶结构，其合成后验证结果如图3所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓蕾，王兴，冯书阳，
申请(专利权)人：沈阳万类生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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