本发明专利技术公开了一种催化效率与热稳定性提高的N‑乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程领域。将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5‑5)的N‑乙酰谷氨酸激酶的基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突变为组氨酸H。本发明专利技术所述的N‑乙酰谷氨酸激酶突变体的催化效率是野生型的2.12倍，在37℃下的半衰期是突变前的2.78倍。本发明专利技术所得N‑乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L‑精氨酸奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种催化效率与热稳定性提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，属于生物工程
技术介绍
L-精氨酸是一种碱性半必须氨基酸，它具有多种生理功能。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)简称NAGK，是L-精氨酸合成途径的第二个酶和关键限速酶，同时它受终产物L-精氨酸的反馈抑制。在ATP的作用下，它催化N-乙酰谷氨酸的λ-COO-磷酸化从而生成L-精氨酸合成的中间体N-乙酰谷氨酸磷酸。L-精氨酸生产方法有水解法和发酵法。水解法存在操作费时，收率和产量低，成本高等问题，并且存在严重的污染而不适合大规模的生产。因此，实现发酵法生产L-精氨酸成为国内外氨基酸工业的一个十分迫切的问题。目前，用来产L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒杆菌与钝齿棒杆菌，为提高精氨酸产量，研究者们利用DNA重组技术结合代谢工程技术调控合成精氨酸的代谢途径，这使得精氨酸的产量大有提高。为进一步提高生产量研究者渐渐开始将研究重点转向L-精氨酸限速酶－－N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)，通过克隆N-乙酰谷氨酸激酶基因并导入其它菌株来表达，以及运用定点突变技术获得解除精氨酸对其的反馈抑制，从而来提高发酵产L-精氨酸的能力。然而，虽然通过克隆N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)并导入其它菌株获得了NAGK的过量表达，但是NAGK的比酶活并不高即NAGK的催化活性较弱，且热稳定性不好即在37℃下NAGK的半衰期为36h，而L-精氨酸的发酵周期是96h。因此，在保持N-乙酰谷氨酸激酶过量表达的基础上，提高其催化效率与热稳定性成为工业生产的迫切需要。因此，本专利技术公开了一种催化效率与热稳定都显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酰谷氨酸激酶的基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突变为组氨酸H。本专利技术所述的N-乙酰谷氨酸激酶突变体F91HNAGK的催化效率(1088mM-1min-1)相对于野生型(513mM-1min-1)提高了2.12倍，并且在37℃下的半衰期由野生型的36h延长到100h，是突变前的2.78倍。
本专利技术所得N-乙酰谷氨酸激酶突变体更有利于精氨酸的生产需求，为高效合成L-精氨酸奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种催化效率与热稳定性都提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体。将来源于钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酰谷氨酸激酶第91位的苯丙氨酸F进行定点突变，将含突变后基因的重组质粒转化进入E.coli BL21进行表达，蛋白纯化后得到催化效率与热稳定性显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体。编码所述突变后N-乙酰谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示所示。所述突变是将第91位的苯丙氨酸F位分别突变为组氨酸H。获得所述突变体的方法，是以pET28a-argB质粒(一种高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌SYPA5-5)为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到含有突变后基因的重组质粒pET28a-argBF91H，将它们分别转化至E.coli BL21进行表达，获得突变体F91HNAGK。获得所述突变体的方法，具体地是：(1)突变表达载体的构建通过分析N-乙酰谷氨酸激酶的3D结构与同源序列的比对，确定91位的苯丙氨酸F为目的突变为点，设计突变实验，将该位点苯丙氨酸F突变为组氨酸H。以pET28a-argB质粒为模版，设计引物，通过重叠延伸PCR进行定点突变得到的突变基因argBF91H以及载体pET28a分别用EcoRI与SalI核酸内切酶进行双酶切后于16℃连接；然后将连接产物直接转化到E.coliJM109菌株，提取重组质粒进行测序。(2)含突变体的基因工程菌的获得制备E.coli BL21(DE3)感受态，将测序正确的重组质粒pET28a-argBF91H转化到感受态E.coli BL21细胞中，筛选转化子。(3)N-乙酰谷氨酸激酶活力测定酶活测定方法：3mL反应液中含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷氨酸，20mmol/L MgCl2，20mmol/L ATP二钠盐，149mmol/L NH20H.HCI及适量粗酶液。于37℃反应1h后，加入lmL反应终止液(1.0mol/L HCI含5％FeCl3·6H20，4％三氯乙酸)终止反应。离心，取上清测定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸收值A540。酶活力单位定义为1个国际单位(U)等于每分钟内生成1μmol产物N-乙酰谷氨酸氧肟酸所需要的酶量。(4)野生型和突变体的动力学参数与热稳定性的测定将重组E.coli BL21培养后破细胞，取上清即为粗酶液，将野生型和突变体经Ni柱纯化
后测定酶活力与蛋白浓度得到比酶活，通过改变底物N-乙酰谷氨酸(NAG)的浓度以及运用双倒数法测得Km，Vm与Kcat的值，以及将野生型和突变体放置37℃水浴不同的时间得到热稳定性曲线。具体实施方式实施例1突变表达质粒的构建及重组E.coli BL21菌株的获得根据Corynebacterium crenatum SYPA5-5的argB基因序列，设计N-乙酰谷氨酸激酶编码基因的两头引物，再根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变中间引物：利用重叠延伸PCR体外扩增获得突变基因。用于定点突变的引物为：PargB F：5’-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3’(EcoRI)PargB R：5’-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG-3’(SalI)PargBF91H Fm：5’-GTTCAAGGGTGGTCACCGTGTGACCACTCCTG-3’PargBF91H Fm：5’-TCACACGGTGACCACCCTTGAACTCGCCCTGG-3’提取钝齿棒杆菌杆菌SYPA5-5基因组为模板；PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s,30个循环；72℃延伸5min，。将所得突变基因片段与克隆载体pET-28a分别用EcoR I与Sal I核酸内切酶进行双酶切，胶回收后将两者混合，加入T4连接酶，于16℃过夜连接，转化至E.coliJM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子，进行双酶切验证，将重组质粒命名为pET28a-argBF91H，并送至上海生物工程公司测序。将测序正确的重组质粒再转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组E.coli BL21菌株实施例2突变体N-乙酰谷氨酸激酶的表达及本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种催化效率与热稳定性显著提高的N‑乙酰谷氨酸激酶突变体，其特征在于，将钝齿棒杆菌来源的的N‑乙酰谷氨酸激酶第91位的苯丙氨酸F突变为组氨酸H。
【技术特征摘要】
1.一种催化效率与热稳定性显著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突变体，其特征在于，将钝齿棒杆菌来源的的N-乙酰谷氨酸激酶第91位的苯丙氨酸F突变为组氨酸H。2.权利要求1所述突变体的编码基因，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐美娟，张景景，杨套伟，张显，葛小勋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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