一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒。包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物、反向引物和探针；前向引物分别为34A‑Rev‑Fp10、35A‑Rev‑Fp4、38A‑Rev‑Fp13、34C‑Rev‑Fp、34T‑Rev‑Fp、35C‑Rev‑Fp、35T‑Rev‑Fp，反向引物均为Kras‑Rev‑Rp，探针分别为34A‑Rev‑Pb4、35A‑Rev‑Pb2、38A‑Rev‑Pb3、34C‑Rev‑Pb、34T‑Rev‑Pb、35C‑Rev‑Pb、35T‑Rev‑Pb。本发明专利技术对Kras基因突变的检测灵敏度和准确性高，特异性好，可分别或同时检测7种不同的突变类型。

【技术实现步骤摘要】
一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒
本专利技术属于基因检测
更具体地，涉及一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒。
技术介绍
RAS基因最早发现于上世纪八十年代初，首先从人膀胱癌细胞系中分离出的一种转化基因，可使NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)发生恶性转化，而从正常人组织中提取的DNA则无此种作用。RAS基因在进化中相当保守，广泛存在于各种真核生物如哺乳类，果蝇，真菌，线虫及酵母中，提示它有重要的生理功能。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——Hras、Kras和Nras，分别定位在11、12和1号染色体上。Kras因编码21kD的RAS蛋白又名p21基因。在RAS基因中，Kras对人类癌症影响最大。Kras基因就像体内一个“开关”：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。因此，Kras基因在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的Kras基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦Kras基因发生突变，它就会持续刺激细胞生长，使细胞内信号传导紊乱，打乱生长规律，细胞增殖失控而癌变，从而导致肿瘤的发生。在不同的癌症当中存在不同的Kras基因突变的比例：胰腺癌90％、结肠癌50％、肺癌30％、卵巢癌15％、甲状腺癌50％、膀胱癌6％左右；另外，红斑性狼疮(SLE)、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎(RA)、肾癌及某些的白血病(Leukemia)等都有较高的Kras基因突变水平。也有研究表明，Kras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的Kras基因高度保持一致。一般认为，Kras基因状态不会因治疗而发生变化。因此，Kras基因突变的及时检测具有很大的意义，检测Kras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。另外，随着人类医学和药物研究水平的提高，药理遗传学(Pharmacogenetics)日渐兴起。研究表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研究药物作用的个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。近年来推向市场的一些肿瘤靶向治疗的主流药物，都相继在其临床试验中建立和确认了相应的预测疗效的基因生物标记物。Kras基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记物之一。Kras蛋白是EGFR(表皮生长因子受体)信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。肿瘤患者Kras基因突变与否显著影响EGFR靶向治疗药物的疗效。最新的临床研究表明，当患者本身不存在Kras基因突变，服用有关靶向治疗药物，能获得明显的治疗效果。例如非Kras基因突变的结直肠癌患者，可受益于Cetuximab和Panitumumab等EGFR抗体药物；另外对非Kras基因突变的晚期非小细胞肺癌患者使用Gefitinib和Erlotinib等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类药物，能明显提高靶向治疗的疗效。美国癌症综合网络(NCCN)提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行Kras基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。Kras基因突变检测已被NCCN列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。综上所述，Kras基因突变的检测对深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的评价、指导用药具有重要的意义。目前，Kras基因突变的检测方法主要是ARMs-qPCR和HRM。(1)ARMs-qPCR：扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)也就是常说的等位基因特异性PCR(allele-specificPCR,ASPCR)，用于对已知突变基因或者基因多态性进行检测。该方法的核心是三条引物的设计，此处的三条引物一般包含两条正向引物和一条公用的反向引物；而这两条正向引物的区别在于引物的3’末端的碱基不同，也就是等位基因或者已知突变的突变碱基和野生碱基，因为TaqDNA聚合酶没有校正活性，且一般只有引物3’端完全和模板互补时才能有效发生扩增反应。所以可以将两条正向引物分别和反向引物配置成反应体系(一个位点需要两个反应)，这样可以结合荧光定量PCR的高灵敏度特性有效的监测两个反应的是否存在扩增，也就可以判断是否突变或确定基因型。然而上述的都是理论上的假设，假如引物其他参数都符合要求(如GC含量、Tm值、无发夹结构等)，单单因为3’末端的碱基不同，使得TaqDNA聚合酶起始扩增的效率不同，换句话说当3’末端为T时，就算不匹配，可能发生扩增的概率大于3’末端为A时的引物，这样就产生了检测特异性不高的因素，很容易造成假阳性。(2)HRM(HighResolutionMelt)：即“高分辨率熔解曲线”，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。不同DNA的熔解温度Tm各不相同，通常片段越长、GC含量越高的片段其熔解温度就越高，因而每条DNA序列都有其特定的熔解曲线和熔解温度。如果在PCR扩增中出现非特异的扩增，那么就会出现多个熔解峰。可以通过熔解曲线判断PCR扩增的特异性，判断反应产物的条带数目。同理，也可以根据熔解温度(熔解曲线)区分不同的扩增片段。该技术在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。最近的研究表明，HRM方法对突变检测的灵敏度可以比拟甚至超过当前的一些SNP/突变分析技术，如DHPLC等，其灵敏度也大大高于测序。这种方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确。但是，该方法也具有所依赖的仪器较昂贵等缺陷，普及利用率较低。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有Kras基因突变检测技术的缺陷和不足，采用独特的创新设计方法，设计优化出一组检测Kras基因突变的引物和探针，并通过对退火温度、使用体系、PCR程序等使用条件的研究优化，成功组建了一种检测Kras基因突变的试剂盒，对Kras基因突变的检测灵敏度高，而且特异性、准确性好，具体使用时既可以分别检测7种不同的突变类型，也可以同时检测7种突变类型，应用更灵活、更广泛。本专利技术的目的是提供一组检测Kras基因突变的引物和探针。本专利技术另一目的是提供一种检测Kras基因突变的试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一组检测Kras基因突变的引物，包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物和反向引物，针对检测7种Kras基因突变型的前向引物分别为34A-Rev-Fp10、35A-Rev-Fp4、38A-Rev-Fp13、34C-Rev-Fp、34T-Rev-Fp、35C-Rev-Fp、35T-Rev-Fp，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～7所示；针对检测7种Kras基因突变型的反向引物均为Kr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组检测Kras基因突变的引物，其特征在于，包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物和反向引物，针对检测7种Kras基因突变型的前向引物分别为34A‑Rev‑Fp10、35A‑Rev‑Fp4、38A‑Rev‑Fp13、34C‑Rev‑Fp、34T‑Rev‑Fp、35C‑Rev‑Fp、35T‑Rev‑Fp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～7所示；针对检测7种Kras基因突变型的反向引物均为Kras‑Rev‑Rp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测Kras基因突变的引物和探针，其特征在于，包括针对性检测7种Kras基因突变型的前向引物和反向引物，以及针对性检测7种Kras基因突变型的探针；其中，所述针对性检测7种Kras基因突变型的前向引物分别为34A-Rev-Fp10、35A-Rev-Fp4、38A-Rev-Fp13、34C-Rev-Fp、34T-Rev-Fp、35C-Rev-Fp、35T-Rev-Fp，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～7所示；所述针对性检测7种Kras基因突变型的反向引物均为Kras-Rev-Rp，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；所述针对性检测7种Kras基因突变型的探针分别为34A-Rev-Pb4、35A-Rev-Pb2、38A-Rev-Pb3、34C-Rev-P...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹鸿志，牛智通，
申请(专利权)人：广州市康立明生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44