一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法技术

本发明专利技术属于植物保护技术领域，提供了一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，该方法包括：获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。本发明专利技术提供的小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法可快速、准确、定量的对小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量进行测量。

【技术实现步骤摘要】
一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法
本专利技术涉及植物保护
，具体涉及一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法。
技术介绍
小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici，Pst)引起的，是世界范围内小麦上的主要病害之一。该病害可以造成严重的小麦产量损失，一旦爆发至少导致小麦减产10％～30％，甚至造成绝产，是我国小麦安全生产的重大威胁。20世纪50年代以来，小麦条锈病在我国多次发生大流行，严重影响了小麦生产，在1950、1964、1990和2002年分别使我国小麦减产60、30、26和14亿kg。田间小麦条锈病的一个侵染过程一般包括接触期、侵入期、潜育期和发病期4个时期。着落于小麦叶片表面的小麦条锈病菌依靠夏孢子萌发产生芽管侵入小麦，侵染初期在小麦叶片内产生大量的菌丝，但是在叶片表面难以观察到病害症状，给病害的早期监测和预测预报造成了诸多困难和不便。小麦条锈病菌的侵染和在寄主体内的扩展是一个动态量变的过程，一旦在叶片上产生条锈病菌夏孢子堆，该病害即可通过气流进行传播。若能做到小麦条锈病菌侵染的早期检测，特别是侵染菌量的定量检测，对于该病害的及早定点防治、预测预报和防治策略的制定具有重要的意义。特别地，若能实现越夏区、越冬区小麦条锈病侵染菌量的早期定量检测，对于小麦条锈病的宏观防控尤为重要。目前，通常通过田间发病情况调查对小麦条锈病进行监测。已有一些新的技术和方法被用于植物病害监测，尤其是高光谱遥感技术、分子生物学检测技术、热红外成像技术和近红外光谱技术等为植物病害的早期检测提供了更为快速简便的手段。通过检测小麦条锈病菌的存在，在小麦条锈病潜育期利用分子生物学技术可以准确定性检测到小麦叶片受到条锈病菌的侵染。利用高光谱遥感技术可以识别健康小麦和受到小麦条锈病菌侵染但尚未表现症状的小麦。已有研究报道利用热外红外成像技术和近红外光谱技术可以在病害症状出现之前检测到小麦条锈病菌的侵染。但小麦条锈病潜育期病原菌定量早期检测方面的研究相对较少。已有研究报道主要是利用real-timePCR方法实现潜育期小麦条锈病菌DNA的定量检测。但是，利用田间发病情况调查方法监测小麦条锈病时费时费力，而且仅能对已发病田块进行调查统计，不能对潜育期条锈病叶片进行准确、快速识别；高光谱遥感技术所用仪器比较昂贵；热外红成像技术对所用仪器成像分辨率和温度分辨率要求较高；分子生物学技术检测过程复杂，对技术和仪器要求较高，且样品易受环境污染。目前虽然已有可在野外定量分析的仪器，但是仍需使用者掌握相应的分子生物学技能，且需要获取大量待检测样品，单纯利用分子生物学技术无法快速获得大面积的分子数据为病害预警提供依据。而且，基于高光谱遥感技术、热红外成像技术和分子生物学技术的病原菌潜伏侵染的检测方法在生产上较难大规模推广应用。因此，急需探求一种简单便捷、准确、快速的小麦条锈病早期检测方法。近红外光谱技术(nearinfraredreflectancespectroscopy，NIRS)是一种准确、无损、稳定的分析技术，该技术分析过程简单、快速，是一种便于在线分析、成本较低的快速检测技术。目前，近红外光谱技术已广泛应用于农业、食品、石油、化工、医药等行业。利用近红外光谱技术可以进行小麦条锈病菌和叶锈病菌夏孢子的定性识别和定量测定。但是，现有技术中仅是利用近红外光谱技术可对小麦条锈病和叶锈病叶片进行早期定性识别，来实现小麦条锈病严重度分级评估，并定性识别受到小麦条锈病菌侵染尚未显症、处于潜育期的小麦。但目前尚无利用近红外光谱技术进行小麦条锈病潜育期菌量定量检测的研究报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提出一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，以解决现有技术存在的不能简单便捷、准确、快速的对小麦条锈病进行早期定量检测的问题。为此目的，本专利技术提供一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，该方法包括：获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。其中，在所述获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息之前，所述方法还包括：构建所述测定模型，具体包括：对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱；计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量；根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型。其中，所述对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱，包括：采用积分球漫反射法采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，得到小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱。其中，所述计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量，包括：分别提取健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA，得到所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA的含量和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量；根据所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA含量，采用多重荧光定量PCR技术，建立所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线；根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量，利用所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA；根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量。其中，所述根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型，包括：根据所述样品的近红外光谱和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型。其中，所述根据所述样品的近红外光谱和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型，包括：从所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱的波长点光谱特征中随机选取m个特征，并将主成分数设置为n，其中，m、n均为预设常数；根据所述m个特征和所述设置为n的主成分数，依次构建k个QPLS测定模型，其中，k为预设常数；将所述k个QPLS测定模型的预测值作为变量，构建SVR测定模型，从而获得kQPLS-SVR测定模型。其中，所述方法还包括：根据预设比例，将所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，分成训练集和测试集；根据所述训练集和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型；根据所述训练集、所述测试集的决定系数R2、校正标准差SEC、预测标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，其特征在于，所述方法包括：获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。

【技术特征摘要】
2016.02.05 CN 20161008200901.一种小麦潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，其特征在于，所述方法包括：S0、构建测定模型；S1、获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；S2、根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用所述测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型；其中，所述步骤S0包括如下细分步骤S01至S03：S01、对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱；S02、计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，即PstDNA；小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量的计算方式为：S03、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型；进一步地，所述步骤S01具体如下：采用积分球漫反射法采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，得到样品的近红外光谱；将每组小麦条锈病潜育期叶片样品剪成碎末状，倒入内径为20mm的样品杯中，在室温下利用MPA傅里叶近红外光谱仪进行近红外光谱采集；采集光谱方式为积分球漫反射，每次采集30条光谱；光谱采集范围为4000-12000cm-1，光谱分辨率为8cm-1，扫描次数32次；整个采集过程直至夏孢子突破叶片表皮，此时潜育期结束；进一步地，所述步骤S02包括如下细分步骤S021至S024：S021、分别提取健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA，得到所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA的含量和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量；S022、根据所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA含量，采用多重荧光定量PCR技术，建立所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线；S023、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量，利用所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA；S024、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量；其中，多重荧光定量PCR技术中使用的引物和探针序列如下：步骤S022中建立DNA标准曲线的过程为：(1)将在步骤S021中提取的已知浓度的条锈病菌DNA依次梯度稀释为1、10-1、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海光，赵雅琼，谷医林，秦丰，温丽，刘彬彬，马占鸿，赵龙莲，李军会，李小龙，程培，潘阳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11