一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法，分别以待鉴定甘蔗和“POJ2878”的基因组DNA为模板，利用引物1和引物2进行扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，与抗褐锈病甘蔗品种POJ2878的酶切产物进行比较，来判断所待鉴定甘蔗的抗病性。本发明专利技术方法可用于甘蔗抗褐锈病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗褐锈病基因位点来预测待鉴定甘蔗对褐锈病的抗性，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加速甘蔗抗褐锈病育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于甘蔗分子生物学及甘蔗抗性鉴定
更具体涉及一个与甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记鉴定方法，同时还涉及该分子标记在甘蔗抗褐锈病育种中的应用。
技术介绍
甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳经济作物，蔗糖长期占世界食糖总产72%以上，其光合效率为C4作物之首，具有高光效特性、生长巨型性、可多年宿根栽培和大量固定CO2等特性，在适宜条件下亩产糖可高达1吨以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。我国为世界第三产糖国和第二食糖消费国，蔗糖占我国食糖总产92%以上，甘蔗对保证我国食糖安全和发展低碳经济有不可替代的作用。根据ISSCT统计，甘蔗品种改良的科技贡献率高达60%。但是，随着甘蔗褐锈病的爆发和流行，致使一些丰产高糖当家品种如Co475、T34362和CP78-1247被淘汰，极大地影响了蔗糖产业的持续稳定发展。由黑顶柄锈菌(PuccinamelanocephalaH.Sydow＆P.Sydow)引起的甘蔗褐锈病是一种重要的世界性甘蔗病害，严重危害甘蔗生长，对蔗农造成巨大的经济损失。该病自1890年在爪哇首次被发现以来，随后迅速扩散到世界上多数植蔗国家和地区，在古巴、牙买加、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国和毛里求斯等植蔗国家和地区普遍发生，并多次暴发流行。我国台湾1977年首次发生甘蔗锈病，1982年首次在中国大陆云南甘蔗种植区发现该病害，之后在福建、广东、四川、江西和广西等蔗区先后报道。目前，该病在国内蔗区普遍发生和蔓延危害，造成甘蔗种质退化、产量降低。发病田块一般减产15％～30％，严重地块减产幅度可达40％以上，蔗糖含量降低10％～36％。尤其近年，我国蔗区主栽的一批丰产高糖品种如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9号”和主推品种“粤糖60号”和“德蔗03-83”等也因高度感染锈病而面临淘汰。甘蔗锈病的流行与品种抗病性密切相关，大面积种植感病品种是病害流行的重要原因，选育和种植抗病品种是防治该病最经济有效的措施。而抗病种质资源的发掘利用是抗病育种的基础和关键。目前，我国对甘蔗锈病抗病资源的筛选鉴定和评价还停留在人工接种表型观察选择，尚未开展抗锈病基因标记选择研究。传统的人工接种表型选择抗病性的方法耗时、低效，鉴定结果易受病原和环境因素影响，难以满足育种家对抗病育种要求。因此，为了保证国家的甘蔗产业可持续健康发展的进行，提高我国甘蔗生产技术水平，迫切需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的鉴定甘蔗抗褐锈病方法，是甘蔗抗褐锈病分子育种最关键的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法，鉴定或辅助鉴定甘蔗抗褐锈病的方法及其在甘蔗抗褐锈病育种中的应用。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定甘蔗抗褐锈病的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定甘蔗和POJ2878的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切，通过电泳检测扩增产物，按照如下方法确定待鉴定甘蔗对褐锈病的抗性：如果待鉴定甘蔗的PCR扩增产物电泳条带有与POJ2878带型相同的条带，且大小为389bp则待鉴定甘蔗为抗褐锈病甘蔗或候选为抗褐锈病甘蔗，如果待鉴定甘蔗的PCR扩增产物电泳条带没有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为非抗褐锈病甘蔗为或为候选非抗褐锈病甘蔗；所述待鉴定甘蔗为桂糖35和科5的杂交后代，上述方法中，所述待鉴定甘蔗具体选自桂糖35（抗褐锈病）和科5（感褐锈病）的杂种后代中的F1单株。在本专利技术的一个实施例中，所述待鉴定甘蔗具体选自桂糖35和科5的杂种后代中的F1单株。具体为：包括如下步骤：分别以待鉴定甘蔗和“POJ2878”的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；扩增程序如下：94℃5min；94℃30S，56℃30S，72℃40S，34个循环；72℃7min。将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，按照如下方法确定待鉴定甘蔗对褐锈病的抗性：如果待鉴定甘蔗的酶切产物电泳条带有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为抗褐锈病甘蔗，如果待鉴定甘蔗的酶切产物电泳条带没有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为非抗褐锈病甘蔗。酶切产物经过胶回收及测序，该抗性片段大小为389bp，其余条带为非特异性扩增。所述引物1为：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2为：417-5’-CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。本专利技术具有以下优点：本专利技术的引物对是与Bru1基因位点紧密连锁的标记，是基于PCR和酶切技术产生的共显性标记，因而可靠且使用方便，与以往的抗褐锈病标记相比，具有与目标基因Bru1紧密连锁、准确性高、检测效率高、成本低廉等优点。1.紧密连锁：实验证明，利用本方法对甘蔗育种材料辅助鉴定的结果与抗性鉴定结果完全一致，表明该方法用于甘蔗抗褐锈病育种的分子标记辅助选择。2.准确性高:与以往的抗褐锈病标记相比，该检测方法克服假阳性高、稳定性差等问题。3.成本低廉：本研究使用限制性内切酶HaeIII属于廉价的四碱基内切酶，而其他方法使用是昂贵的六碱基核酸内切酶RsaI。本专利技术通过对甘蔗抗褐锈病基因的定位，开发与其紧密连锁的分子标记方法，该方法可用于抗病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗褐锈病基因位点来预测甘蔗对褐锈病的抗性，可以在甘蔗的实生苗阶段进行淘汰选择，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加速甘蔗抗褐锈病育种进程。附图说明图1PCR扩增后直接进行电泳分析结果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分别代表甘蔗样品编号为甘蔗品种POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粤甘35号，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合庆割手密，云南83-215，贵州78-2-04。图2PCR产物利用RsaI酶切后进行电泳分析结果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分别代表甘蔗样品编号为甘蔗品种POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粤甘35号，崖城05-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的引物，其特征在于：所述引物序列为引物1：29‑5’‑TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT‑3’；引物2：417‑5’‑ CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的引物，其特征在于：所述引物序列
为引物1：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；引物2：417-5’-
CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
2.一种利用权利要求1所述的引物用于鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标
记方法，其特征在于：包括如下步骤：分别以待鉴定甘蔗和“POJ2878”的基因组DNA为模板，
PCR扩增体系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μ
L，25ng/μL模板DNA2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晋隆，卢运海，许莉萍，王恒波，阙友雄，刘迪，肖乃衍，陈平华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35