具有增加的锈病抗性的转基因谷类植物制造技术

提供了具有增加的对叶病原体引起的疾病的抗性的转基因小麦2174品种，同样提供了用于制造该转基因品种的方法。所述方法涉及基因工程改造(转化) 2174以过表达编码正确剪接形式的抗性基因LR34的cDNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有增加的锈病抗性的转基因谷类植物 与相关申请的交叉引用 本申请要求于2013年6月3日提交的美国临时专利申请序列号61/830，444的权益，并通 过引用将所述临时申请结合到本文中，如同其此时被全部列出一样。 关于联邦资助的研究或开发的声明 本专利技术在农业部授予的USDA/NIFA批准号2011-68002-30029下在美国政府支持下进 行。政府对本专利技术具有一定的权利。 专利
本专利技术一般地涉及总体上改善农作物植物的领域，并且更具体地，涉及具有增加 的锈病抗性的转基因2174小麦品种。 专利技术背景 小麦为全世界的主要食物作物，但不断地受到数种真菌疾病，例如叶锈病和条锈病的 挑战。存在对于宿主植物对流行病原体的抗性已经定位的许多基因或数量性状位点 (QTL)，包括对于条锈病的67个基因/QTL和对于叶锈病的49个基因 /QTL 。这些基因 /QTL 的抗性可分为两种类型：i)完全或质量抗性，和ii)部分或数量抗性。质量抗性符 合基因对基因模型，其中病原体由植物宿主抗性基因识别，导致病原体的完全排除。数 量抗性仍然知之甚少，但通过两种假设解释:i)多重抗性基因之间的相互作用的结果，或ii)病原体效应器与植物防御蛋白之间的直接相互作用或病原体效应器与该效应 器触发的植物防御蛋白之间的间接相互作用的结果。 Lr34是赋予对引起叶锈病、条锈病和白粉病的真菌病原体的抗性的非种族特异性 基因，其还赋予对大麦黄矮病毒的抗性。由于其对多种病原体的抗性的持久性和非 特异性，Lr34成为全世界小麦中最重要的疾病抗性基因之一，并且自21世纪初就已经被利 用。1^34的克隆表明该基因的抗性等位基因由24个外显子和23个内含子组成，从起 始密码子到终止密码子跨越11，805 bp的核苷酸序列，并且其编码多种药物抗性(PDR)-样 腺苷三磷酸-结合盒(ABC)转运体，该转运体由两个单元组成，每个单元包含一个胞质核苷 酸结合结构域(NBD)和一个疏水跨膜结构域(TD) 。抗性等位基因 Lr34r和敏感等位基因 Lr34s可通过三个多态性区分。第一个为在Lr34Ells等位基因的外显子11中存在但在 Lr34Ellr等位基因中缺失的编码苯丙氨酸的密码子TTC，第二个为外显子12中从"C"至"T" 的点突变，产生Lr34E12S蛋白中的酪氨酸残基和Lr34E12r蛋白中的组氨酸残基。第 三个为Lr34E22s在外显子22中包含一个点突变，产生过早的终止密码子和缺乏覆盖大部分 第二跨膜结构域的185个氨基酸的缩短的、无功能Lr34E22s蛋白。三个突 变中的每个均已在蛋白水平表征但未在转录水平表征。 先前在适应南部大平原的冬小麦品种上的研究表明Lr34是自携带敏感Lr34等位 基因的"Jagger"与携带抗性Lr34等位基因的"2174"的成对杂交的重组自交系(RIL)中叶锈 病反应的总表型变异的18-35%的原因。在其它研究中也报道Lr34是叶锈病反应变异的 29-33%的原因。然而，该基因赋予的部分抗性的分子机制在很大程度上仍是未 知的。因此，Lr34基因在小麦育种中的部署仍基于传统的育种方法，通过该方法将来自供体 的抗性等位基因引入携带敏感等位基因的受体品种。 对Lr34转录缺陷和其对进一步的下游或上游蛋白的作用的彻底理解将明显有助 于建立持久的疾病抗性途径，并允许基因工程改造抗锈病和其它真菌疾病的小麦。 专利技术概述 Lr34是一个赋予对真菌病原体包括叶锈病、条锈病、茎锈病和白粉病，以及大麦黄矮病 毒的抗性的非种族特异性基因。由于其对多种病原体的抗性的持久性和非特异性，Lr34成 为全世界小麦中最重要的疾病抗性基因之一。然而，Lr34的抗性为部分的，因此其被称为 "微效"基因。 本公开内容描述了成为小麦成株（Triticum aestivum，2n=6x=42，AABBDD)中 Lr34对叶锈病的部分抗性的基础的新机制。如下面所更充分解释的，在携带抗性Lr34等位 基因的品种中，由于多个错误剪接事件导致，仅一部分(35%)的其转录物正确剪接并且大部 分(65%)的其转录物不正确地剪接。Lr34剪接对低温敏感，与成株相比，其在幼苗中产生更 高比例的和更多形式的错误剪接转录物。从错误剪接的cDNA推导的蛋白在长度上为不完整 的并且缺乏TaFKBPl (小麦(T. aestivum)中第一个表征的亲免蛋白）的相互作用位点。 然而，当在携带抗性等位基因的转基因品种中过表达正确剪接的Lr34 cDNA时，功 能性Lr34转录物水平显著增加并且转基因小麦显示增加的叶锈病抗性。这些发现显示可通 过克服错误剪接的作用增加数量基因赋予的抗性水平。 附图简述 图1A-K.衍生自Lr34的错误剪接的cDNA的结构。A，由24个外显子和23个内含子组成的 Lr34基因结构。B，正确剪接的Lr34 mRNAX-I，左部分:作为跳跃或盒式外显子(CE)、内含子 保留（IR)、选择性3 '剪接位点(A3SS)和选择性5 '剪接位点(A5SS)描述的选择性剪接事件的 位置。C，部分外显子10跳跃，外显子10的5'末端处的92 bp (C1)和11 bp (C2KD，外显子12 的5末端处的44 bp跳跃。E，完整的外显子16跳跃。F，完整的内含子1保留。G，完整的内含子 9保留。H，完整的内含子14保留。I，内含子6分别以该内含子3'末端处的12 bp (G1)或17 bp (G2)部分保留。C-I，右部分，Lr34推导的蛋白。灰箱指示外显子，线指示内含子，虚线箱指示 跳跃的外显子，黑箱指示保留的内含子，星形指示mRNA中错误剪接的片段，心形指示过早的 终止密码子。J，Jagger的无功能LT3H2174的功能性Lr34的蛋白结构，由两个单元组成， 每个单元包含一个胞质核苷酸结合结构域(NBD)和一个疏水跨膜结构域(TD)。 图2A-C.活细胞中瞬时表达的Lr34和TaFKBPl蛋白的亚细胞定位和体内相互作 用。A，PEG101表达的TaFKBPl-YFP蛋白在细胞质膜(M)以及核(N)上的亚细胞定位。该图像用 明亮滤光器(BF)获取以指示用携带构建体的根癌农杆菌(A. tumefaciens)浸润的叶的背 景，或用紫外滤光器(DAPI)获取以指示用f，6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核的位置。叠加 的图像对齐GFP的位置与DAPI-染色的核。B，PEG101表达的两个Lr34-YFP蛋白片段{(1-510 位和750-1401 (末端)位的氨基酸）}在烟叶活细胞的细胞质膜中的亚细胞定位。C，Lr34和 TaFKBP 1蛋白的B iFC分析。黄色荧光蛋白由Lr 34-YN与TaFKBP 1-YC之间的体内相互作用导 致。图像在具有GFP滤光器的荧光显微镜下获取以指示当Lr34和YC载体相互作用或 TaFKBPl和YN载体相互作用用作阴性对照时信号的缺失。所有图像的比例尺均表示50 μπι。 图3A-D. TaFKBPl对疾病抗性的遗传效应。A，TaFKBP-Al的PCR标志。PCR产物在1% 琼脂糖凝胶中直接电泳，显示来自Jagger等位基因而非来自2174等位基因的多态性条带。 使用中国春缺_四体系（Chinese spring nul本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含天然Lr34抗性基因的转基因2174小麦品种，其经基因转化以包含和表达缺乏内含子并且编码Lr34抗性转基因的cDNA序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L严，B卡弗，T方，RM亨格，
申请(专利权)人：俄克拉荷马州大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国;US