转基因玉米T4‑1‑1品系特异性检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术设计了用于检测转基因玉米T4‑1‑1的品系特异性的4对PCR检测引物。本发明专利技术还提供了包含所述引物的试剂盒。经实验证明，应用本发明专利技术的检测引物对转基因玉米T4‑1‑1品系特异性的PCR定性检测，特异性强、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
转基因玉米T4-1-1品系特异性检测方法及试剂盒
：本专利技术涉及一种转基因作物的品系特异性检测，特别涉及转基因玉米T4-1-1品系特异性PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
：在对进行转基因植物及其加工产品进行成分定性检测时，可根据其检测的特异性分为筛选检测方法、基因特异性检测方法和品系特异性检测方法等。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列。品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。根据《转基因植物及其产品成分检测》国家标准，品系特异性检测方法中往往对特异性PCR反应扩增的产物有一定要求，即长度120-300bp之间、扩增条带单一、并可用于多种仪器进行结果显示。这样符合检测上快速、准确、特异的要求，更加方便转基因产品成分检测上的应用。转基因玉米T4-1-1品系是由四川省农业科学院生物技术核技术研究所开发的玉米品系，具有极好的抗除草剂能力。目前尚未有任何关于转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供转基因玉米T4-1-1品系特异性PCR检测方法及试剂盒。为达到上述目的，要解决的关键技术是提供合适的用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测引物。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术首先根据转基因玉米T4-1-1的3’端侧翼序列(SEQIDNo.9)，设计了用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测引物，其核苷酸序列选自以下引物对1～4中任一：引物对1：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；引物对2：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；引物对3：SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；引物对4：SEQIDNo.7和SEQIDNo.8。其中，经实验证实，引物对1的扩增效率最高。本专利技术还提供了一种用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括有上述的4对PCR检测引物中任一。优选的PCR检测引物是引物对1。由此，本专利技术建立了一种转基因玉米T4-1-1品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用前述的PCR检测引物。上述方法的具体步骤如下：(1)提取待检测水稻样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的PCR检测引物，建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增；(3)根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQIDNo.10的DNA片段的条带，确定品系特异性：如果扩增出该条带，则确定被检测的样品是转基因玉米T4-1-1；如果不能扩增出，则确定不是转基因玉米T4-1-1。其中，所述的从待检测样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。在上述方法中，PCR反应体系和扩增条件对检测效果有影响。特别是，PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测结果的特异性、灵敏度；本专利技术考察了PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度对于检测的特异性和灵敏度的影响，实验结果发现在引物终浓度为0.2μM、退火温度为58℃时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。本专利技术中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，10×PCR缓冲液5μL，dNTPs混合溶液2μL，10μmol/LSEQIDNo.1所示的引物1.0μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1.0μL，5U/μLGoTaq酶0.2μL，25mg/LDNA模板2.0μL，余量为双蒸水。所述的PCR扩增条件优选为：94℃，5min；94℃，20s，58℃，20s，72℃，20s，35个循环；72℃，2min。采用本专利技术建立的转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR定性检测方法对常规玉米吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281和转基因玉米T4-1-1、GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604以及其它转基因植物(例如：水稻科丰6号、大豆356043、棉花MON1445和油菜MS1等)进行了定性检测。定性PCR扩增结果表明，在转基因玉米T4-1-1基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(293bp)，在其它转基因植物以及常规玉米等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段；通过测序分析表明转基因玉米T4-1-1基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。实验结果表明，本专利技术所建立的转基因玉米T4-1-1品系特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。检出限实验结果表明，转基因玉米T4-1-1成分为1％、0.5％、0.1％、0.05％的PCR反应中均扩增出了目的片段大小的条带，说明本专利技术转基因玉米T4-1-1品系特异性PCR定性检测方法的检出限为0.05％，具有高度的灵敏性。附图说明图1引物扩增结果，其中M：100bpDNAmarker；1：空白对照；2：阴性对照；3：引物1；4：引物2；5：引物3；6：引物4。图2PCR反应体系中引物1终浓度和退火温度优化结果：M：Trans2KplusIIDNAMarker；1-5引物终浓度为0.1μM/L；1：55℃；2：56℃；3：58℃；4：60℃；5：62℃；6-10引物终浓度为0.2μM/L；6：55℃；7：56℃；8：58℃；9：60℃；10：62℃；11-15引物终浓度为0.5μM/L；11：55℃；12：56℃；13：58℃；14：60℃；15：62℃；16-20引物终浓度为1.0μM/L；16：55℃；17：56℃；18：58℃；19：60℃；20：62℃。图3转化体方法特异性检测；M：Trans2KplusIIDNAMarker；1：空白对照；2：阴性对照；3：T4-1-1样品；4-13：分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8、样品9、样品10。图4转化体方法检测限测试结果。A灵敏度测试结果；M：Trans2KplusIIDNAMarker；1：空白对照；2：阴性对照；3-7分别为：T4-1-1阳性1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％。B检测限测试结果；M：Trans2KplusIIDNAMarker；1-10：T4-1-1阳性0.05％的10个平行；11-20：T4-1-1阳性0.01％的10个平行。实施例1转基因玉米T4-1-1的品系特异性定性检测引物的筛选1、引物的设计根据T4-1-1插入基因载体和其3’端旁侧序列的连接区序列(SEQIDNo.9)为靶序列设计4对转化体特异性引物，引物序列如下：引物1：扩增产物片段大小为293bp1-F：TCGTGAGAGTTTAGCGATTGG(SEQIDNo.1)1-R：ATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT(SEQIDNo.2)引物2：扩增产物片段大小为176bp2-F：GAATCTTAGCTGTCCATGTTGGG(SEQIDNo.3)2-R：GGATAAATTATCGCGCGCG(SEQIDNo.4)引物3：扩增产物片段大小为270bp3-F：AATGGAATCTTAGCTGTCCA(SEQIDNo.5)3-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测转基因玉米T4‑1‑1的品系特异性PCR检测引物，其核苷酸序列选自以下引物对1～4中任一：引物对1：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；引物对2：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；引物对3：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；引物对4：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。

【技术特征摘要】
1.用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测引物对，其引物对是以下核苷酸序列：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。2.用于检测转基因玉米T4-1-1的品系特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括有权利要求1所述的PCR检测引物对。3.一种转基因玉米T4-1-1品系特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的PCR检测引物对。4.权利要求3所述的方法，步骤如下：(1)提取待检测样品的DNA，其检测样品选自玉米吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281、转基因玉米T4-1-1、GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604、水稻科丰6号、克螟稻、M12、TT51、大豆356043、305423、CV127、MON89788、A2704-12、GTS40-3-2、棉花MON1445、MON88913、LLCOTTON25、MON15985、油菜MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、O...

【专利技术属性】
技术研发人员：周正富，张维，余桂容，徐利远，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11