一种维生素A中间体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种维生素A中间体3,7-二甲基-9-(2’,6’,6’-三甲基-1-环己烯)基-2,4,7-三烯-1,6-二醇-1-乙酸酯的制备方法，所述方法为：以米曲霉WZ007经发酵培养获得的培养液过滤，滤饼干燥获得的干菌体为催化剂，以3,7-二甲基-9-(2’,6’,6’-三甲基-1-环己烯)基-2,4,7-三烯-1,6-二醇为反应底物，以酰化剂的有机溶剂溶液为反应介质，在30～50℃、200rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼回收催化剂，滤液即为含维生素A中间体的混合液，将混合后分离纯化，获得维生素A中间体；本发明专利技术所述中间体的制备方法所用酶的区域选择率达到99.5％，反应转化率高达100％，催化剂可以重复利用，下游分离简单，能耗低，大大降低了生产成本，环境污染小，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种维生素A中间体的制备方法 (-)
本专利技术设及一种维生素A中间体的制备方法，特别设及一种W中间体I(3, 7-二 甲基-9-(2'，6'，6'-^甲基-1-环己締）基-2,4,7-^締-1，6-二醇）为反应底物，在脂 肪酶的作用下进行区域选择性酷化反应合成中间体II(3, 7-二甲基-9-(2'，6'，6'甲 基-1-环己締）基-2, 4, 7-S締-1,6-二醇-1-乙酸醋）的方法。 (二）
技术介绍
维生素A(vitaminA) [CAS:68-26-引又称视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元 醇，包括维生素A1、A2两种。维生素A是保护眼晴和增进视力的营养素，具有促进生长发 育，加强免疫能力和清除自由基等功能。维生素A不足会引发夜盲症。维生素A只存在于动 物性食物中，Al存在于哺乳动物及咸水鱼的肝脏中，而A2存在于淡水鱼的肝脏中。虽然维 生素A可W从动物组织中获取，但是资源有限，步骤繁琐，成本高。因此目前维生素A主要 通过化学合成的方法得到。其中RocheC14+C6合成工艺为世界上采用最广泛的路线。维 生素A中间体II是该技术路线中的重要中间体，通过维生素A中间体I乙酷化得到。维生 素A中间体II再经过漠代，脱漠重排得到维生素A醋酸醋。 US3671575中使用醋酢或者酷氯做酷化剂，利用化晚类，胺类有机碱作为催化剂进 行酷化反应。该方法存在有机碱在反应后进行酸洗，碱化和除水W及蒸馈分离等步骤，过程 复杂且存在大量的能耗和废水。 EP0802261 利用lipase化C、lipasePLG、LipozymeIM-20、chirazyme等商 品酶催化维生素A中间体I乙酷化合成维生素A中间体II，反应条件溫和，转化率高。但是 商品酶价格昂贵，稳定性较差，造成生产成本较高。 (H)
技术实现思路
阳〇化]本专利技术目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产脂肪酶微生物，提供了一种 廉价高效的脂肪酶，W维生素A中间体I为反应底物，在脂肪酶的作用下进行区域选择性 乙酷化得到维生素A中间体II的方法。阳007] 本专利技术采用的技术方案是： 进一步，底物用量W反应介质体积计为50~200g/L反应介质，催化剂加入量W反 应介质体积计为10~50g/L反应介质，所述酷化剂的有机溶剂溶液中酷化剂体积浓度为 1 ~40%。 进一步，有机溶剂为下列之一：正己烧、环己烧、甲基叔下基酸、甲苯、苯、乙酸或氯 仿，更优选正己烧、环己烧、甲基叔下基酸。 进一步，所述催化剂还可W为从米曲霉（AspergillusO巧zae)WZ007经发酵培 养获得干菌体中提取米曲霉WZ007脂肪酶粗酶或米曲霉WZ007脂肪酶粗酶制备的米曲霉 WZ007脂肪酶固定化酶。 进一步，所述干菌体按如下方法制备：（1)斜面培养：将米曲霉WZ007接种至斜面 培养基，30°C培养3天，作为斜面活化种子；斜面培养基终浓度组成：NaN〇3 0. 1~0. 3%， K2HPO40. 1 ~0. 2%，KC1 0. 3 ~0.7%，FeS〇40.OOl~0. 002%，M拆〇40. 04 ~0. 06%，薦糖 2~5 %，琼脂1. 5~2.0%，溶剂为去离子水，pH自然；优选斜面培养基终浓度组成：NaN〇3 0.2%，K2HP040. 1%，KC1 0.5%，FeS〇40.001%，MgS〇40. 05%，薦糖 3%，琼月旨 1. 5%，溶剂 为去离子水，pH自然； (2)发酵培养：将斜面种子接种至液态发酵培养基，30~37°C、摇床转速150~ 2(K)r/min培养2~3天，过滤，得到菌丝体，(TC冷冻干燥2地，获得干菌体；液态发酵培养 基终浓度组成为：葡萄糖2~6 %，蛋白腺2~5 %，薦糖1~6 %，尿素0. 3~0. 9 %，化Cl 0.4 ~0.8%，K2HP04 0 . 2 ~0.5%，M拆O40. 1 ~0.3%，（畑4)25〇4 0.4 ~0.8%，溶剂为去离 子水，pH自然；优选液态发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/l，蛋白腺20g/l，薦糖IOg/ L，尿素 3g/l，化Cl5g/L，K2HP〇4 2g/L，M拆〇4Ig/L，（畑4)25〇4 5g/L，溶剂为去离子水，pH自 然。 进一步，米曲霉WZ007脂肪酶粗酶的制备方法为：将米曲霉WZ007经发酵培养获 得的干菌体用抑值为7.0憐酸缓冲液悬浮（缓冲液用量能够将干菌体悬浮混匀即可，缓 冲液体积用量通常为5ml/g干菌体）后的悬浮液进行破碎（优选超声破碎的条件：30KHz， 60~80W，60min)，离屯、，取上清液加入硫酸锭至60 %饱和度进行沉淀，离屯、，取沉淀浸泡在 抑值为7.0憐酸缓冲液（缓冲液用量能够将沉淀浸没即可，优选缓冲液用量为2ml/g沉淀） 中，-20~0°C冷冻干燥后，获得米曲霉WZ007冻干酶粉，即为米曲霉WZ007脂肪酶粗酶；所 述硫酸锭的加入量W上清液体积计为0. 5~0.6g/ml。 进一步，米曲霉WZ007固定化脂肪酶制备方法为：将米曲霉WZ007经发酵培养后获 得的干菌体用抑值为7.0憐酸缓冲液悬浮后的悬浮液进行破碎，离屯、，取上清液加入硫酸 锭至60 %饱和度进行沉淀，离心取沉淀浸泡在抑值为7.0憐酸缓冲液中，-20~0°C冷冻 干燥后，获得米曲霉WZ007冻干酶粉，即为脂肪酶粗酶；将脂肪酶粗酶加入抑值为7. 0憐酸 缓冲液中（缓冲液用量能够将脂肪酶粗酶混匀即可，优选缓冲液用量为4ml/g粗酶），再加 入娃藻±，100~20化pm摇床揽拌化后过滤，取沉淀用蒸馈水清洗后，获得米曲霉WZ007固 定化脂肪酶；所述娃藻上与脂肪酶粗酶质量比为1~5 :1。 进一步，混合液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液过滤除去脂肪 酶，滤液减压蒸馈至无液体流出除去溶剂和酷化剂，浓缩物干燥，获得3, 7-二甲 基-9-(2'，6'，6' -S甲基-1-环己締）基-2,4,7-^締-1，6-二醇-1-乙酸醋。 本专利技术所述米曲霉（Aspergilluscxryzae)WZ007,保藏于中国典型培养物保藏中 屯、，保藏编号CCTCCNo:M206105,保藏日期2006年10月8日，已在化200610154832. 4申 请中公开。所述米曲霉WZ007由±壤中筛选得到，通过发酵得到菌体，干燥等处理后得到酶 制剂用于酶法合成中间体II，一次醋化率为90-100 %，精制得到了高纯度的产品。 阳0化]本专利技术米曲霉WZ007的18SrDNA序列如下，大小为59化P: TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCG TGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCC GCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACA ATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维生素A中间体3,7‑二甲基‑9‑(2’,6’,6’‑三甲基‑1‑环己烯)基‑2,4,7‑三烯‑1,6‑二醇‑1‑乙酸酯的制备方法，其特征在于所述方法为：以米曲霉(Aspergillus oryzae)WZ007经发酵培养获得的培养液过滤，滤饼干燥获得的干菌体为催化剂，以3,7‑二甲基‑9‑(2’,6’,6’‑三甲基‑1‑环己烯)基‑2,4,7‑三烯‑1,6‑二醇为反应底物，以酰化剂的有机溶剂溶液为反应介质，在30～50℃、200rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼回收催化剂，滤液即为含维生素A中间体3,7‑二甲基‑9‑(2’,6’,6’‑三甲基‑1‑环己烯)基‑2,4,7‑三烯‑1,6‑二醇‑1‑乙酸酯的混合液，将混合液分离纯化，获得3,7‑二甲基‑9‑(2’,6’,6’‑三甲基‑1‑环己烯)基‑2,4,7‑三烯‑1,6‑二醇‑1‑乙酸酯；所述酰化剂为下列之一：乙烯乙酸酯、乙酸异丙烯酯、乙酸酐或乙酸乙酯。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪钊，郑建永，王升帆，皮士卿，彭后辉，章银军，
申请(专利权)人：浙江工业大学，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，
类型：发明
国别省市：浙江;33