一种检测ERCC1基因多态性的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种检测ERCC1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现ERCC1基因多态性的特异性检测，准确性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其设及一种检测ERCC1基因多态性的引物与方 法。
技术介绍
销类抗癌药物，包括顺销、卡销和奥沙利销等，是目前临床应用中对多种癌症具 有较高活性的抗癌药物，主要通过引起细胞内DNA损伤来清除癌细胞。 切除修复交叉互补基因UERCC1)，为人类DNA损伤修复基因，位于染色体 19ql3. 2-13. 3。切除修复交叉互补基因2巧RCC2)，参与核巧酸切除修复和基因转录，在DNA 损伤修复中起着重要作用。 现有研究数据显示，ERCC1_C118TC/C，C/T，T/T基因型频率分别约为52. 6〇/〇， 43. 1%，4. 2% ;ERCC2_L751QK/K，K/Q，Q/Q基因型频率分别约为 84. 92%，15. 08%，0%。因此， 通过ERCC1基因多态性的检测，有助于预测销类药物化疗的预后，在帮助指导用药和个性 化治疗方面具有重要意义。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、可实现ERCC1基因多态 性检测的引物及其方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测邸CC1基因多态性的引物与 方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了ERCC1基因多态性的检测。本专利技术 检测的位点包括ERCC1_C118T;c. 354T〉C(p.Asnll8=)(SNP;rsll615)。[000引本专利技术提供一种检测邸CCl基因多态性的引物，包括PCR扩增引 物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC1_C118T的 上游引物 5' -TCCAGAACACTGGGACATGA-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物 5，-TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3,（SEQIDNO. 2);所述SNaPshotPCR引物包括；针对ERCC1_ C118T的SNaPshotPCR引物 5，-TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3,（沈QID NO. 3) 0 采用上述技术方案，本专利技术提供的检测邸CCl基因多态性的引物，可w实现邸CCl 基因多态性的特异性检测，准确性好。[000引相应地，本专利技术还提供一种检测邸CC1基因多态性的方法，包括如下步骤；A)提取DNA样品；B)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化； C)采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，对扩增产物进行 纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括；阶段1 ;98°C3min;阶段2 : 981：1〇3;阶段3;581：3〇3;阶段4;721：1111111;阶段5;返回到阶段2,29个循环；阶段6; 72°C5min;阶段 7;25°C保温。即，St巧 1 ;98。Cfor3minutes;Step2 ;98。Cfor10 seconds;Step3 ；58°Cfor30seconds;Step4 ；72°Cfor1minute;Step5；Goto step2,29times;Step6 ；72°Cfor5minutes;Step7 ；25°Cforever。 所述步骤c)中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括；阶段1;96它10s;阶段2: 55它5s;阶段3;6(TC30s;阶段4;返回到阶段1，25个循环；阶段5:4它保温。即，St邱 1 ；96°CforlOseconds;Step2 ；55°Cfor5seconds;Step3 ；60°CforSOseconds; Step4；Gotostep1，25times;Step5 ；4°Cforever。 优选地，所述步骤D)中，采用GE肥MAP阳RIDV4. 1软件对检测结果进行分析。 此外，本专利技术还提供检测ERCC1基因多态性的引物在制备检测ERCC1基因多态性 试剂中的用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测ERCC1基因多态 性的引物，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本专利技术还提供了一种检测 ERCC1基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物， 具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W为销类药物的临床用药提供指导。【附图说明】 图1本专利技术提供的ERCC1基因引物的扩增片段。 图2ERCC1基因引物扩增产物的部分测序图。 图3样品的ERCC1基因多态性检测结果图。【具体实施方式】[001引下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。[001引实施例一引物 专利技术人针对ERCC1的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和 比较，筛选出了特异性好的引物。本专利技术提供的引物包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引 物，PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本专利技术提供的所有引物序列均通过 UCSC数据库比对，无已知SNP位点。实施例二引物的特异性 将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting,ERCC1_C118T引物扩增片段位于C虹19: 45923504-45923722,长度为219bp;结果如图1所示，引物的扩增片段均覆盖了相应的检测 位点，无其它同源基因。 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，引物扩增片段与ERCC1基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshotPCR 引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位置及测序反 应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。 实施例二ERCC1基因多态性的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen，货号；DP318)的说明书，将DM样品稀释至l(K)ng/yL，备用。[002引 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2XMasterMix(购自肥B公司，货号；M049化），反 应体系如表2所示，ERCC1_C118T的引物浓度为5pmol/uL。PCR扩增反应条件包括；阶段1 ; 98°C3min;阶段2;98°C10s;阶段3;58°C80s;阶段4;72°CImin;阶段5;返回到阶段2， 29个循环；阶段6 ;72°C5min;阶段7 ;25°C保温。PCR扩增结束后，取2. 0yLExoSAP-IT (购自Affymetrix，货号；78205)和3. 0yLd地20,混匀，加入PCR扩增产物2. 0yL，混匀微 离屯、；在PCR仪中进行酶切反应，程序；37°C，15min;80°C，15min;4°C，保温。采用SNaPshot?MultiplexKit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如 表3所示，6贿(：1_(：1181'的引物浓度为59111〇1/祉。5化?311〇1?0?反应条件包括；阶段1;961： 10s;阶段2;55°C5s;阶段3;6(TC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测ERCC1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对ERCC1_C118T的上游引物5’‑TCCAGAACACTGGGACATGA‑3’和下游引物5’‑TCCCTATTGATGGCTTCTGC‑3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对ERCC1_C118T的SNaPshot PCR引物5’‑TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵薇薇，胡昌明，燕启江，郭周萍，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44