一种沼泽型水牛SSR引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，通过构建沼泽型水牛Unigene序列，结合Perl编程语言方法，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，以沼泽型水牛基因组DNA为材料，对设计的SSR引物进行验证，从17201对引物中随机筛选了115对引物对7个水牛品种35头个体基因组DNA进行了验证，其中69对引物表现出多态性并可以成功区分不同地理来源的水牛材料。本发明专利技术可为水牛分子标记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种巧译型水牛SSR引物及其应用
本专利技术设及基因工程
，具体设及沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品 种遗传多样性中的应用。 【
技术介绍
】[000引据FA0 2013年的统计数据显示，2011年底我国水牛存栏量为2338. 2万头，仅次于 印度11291. 6万头和己基斯坦3172. 6万头，位居世界第=，可谓资源丰富。中国水牛属于沼 泽型类型，具有耐粗饲、役力大、耐湿、耐高温、抗病力强等生物学特点，是我国南方地区重 要的畜种，其资源丰富，奶质优良，营养丰富，具有"奶中之王"之美称。但我国水牛产奶量较 低，其泌乳性能远低于世界著名的=大河流型水牛品种（摩拉、巧里-拉菲和地中海水牛）。 为提升本地水牛的泌乳性能，我国自上世纪50年代和70年代分别从印度和己基斯坦引进 摩拉和巧里-拉菲水牛加W改良，并取得了较大成效。尽管其产奶量得到了较大的提高，但 仍存在着明显的差异。因此，开发先进的分子标记辅助选择技术应用于优良的奶水牛品种 选育，对于改善水牛种质资源的创新与利用，尤其是有效的提高选种效率具有重要的意义。 分子标记是W个体间遗传物质内核巧酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平 遗传多态性直接的反映，可广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴 另IJ、基因库构建、基因克隆等研究领域。微卫星标记，又称简单重复序列（SSR)，均匀分布于 真核生物基因组中，由1-6个核巧酸的串联重复片段构成。由于SSR重复基序和重复次数 的不同使其在个体间呈高度变异性，且数量丰富，被广泛应用与遗传杂交育种、绘制染色体 遗传图谱等领域。与其他的分子标记（RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等）相比，SSR标记具 有多态性信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好和特异性强等特点。 目前，SSR标记可分为基因组SSR(拆SR)和转录组SSR(EST-SSR)，且后者比前者更 具有经济和效率。由于EST-SSR来源于DNA的转录区域，还比前者更具通用性。传统的SSR 标记开发，一般使用文库筛选、磁珠富集法W及EST数据库挖掘等手段，存在着费时费力、 开发成本高等不足。尤其是第=种方法严重依赖于NCBI中EST数据库，对于尚未公布基因 组测序信息的物种而言，其应用是有限的。但随着第二代测序技术的成熟，W及转录组测序 数据信息的与日俱增，使其成为了开发EST-SSR的重要手段，并具有方便、快捷、准确且成 本低廉等优势。目前，沼泽型水牛尚无全基因组序列信息，且SSR引物数量又少。显然，不 依赖于参考基因组的转录组测序可成为大规模开发沼泽型水牛SSR引物的重要方法，利用 该技术构建沼泽型水牛转录本，并W转录本为参考，组建unigene序列，进行后续的SSR挖 掘。鉴定出有效的沼泽型水牛SSR标记，对于沼泽型水牛重要经济性状相关基因的定位、克 隆及分子标记辅助选择育种等研究具有重要的科学意义。 【
技术实现思路
】 本专利技术提供了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，本专利技术通过构建相应的SSR引 物，对水牛个体的基因组DNA进行SSR扩增，通过扩增产物分析沼泽型水牛的遗传多样性， 为沼泽型水牛的重要经济性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种等研究提供 新的思路。本专利技术所采取技术方案是：沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样 性中的应用，所述方法包括W下步骤： 1)沼泽型水牛SSR引物的获得；分别提取沼泽型水牛各组织器官的总RNA，利用转 录组测序获得沼泽型水牛转录组的RawReads,构建沼泽型水牛化igene序列，对化igene 进行SSR位点的检索，再对含有SSR位点信息的Unigene序列进行引物设计，获得一系列沼 泽型水牛SSR引物； 2)实验材料：随机选取7个水牛品种35头个体作为模板，即摩拉水牛、巧里-拉 菲水牛、西林水牛、富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于检测沼泽型水牛SSR引 物在不同水牛品种遗传多样性分析中的有效性； 3)血液基因组DNA提取；针对每一头水牛个体，颈静脉取血5血，采用动物血液基 因组DNA试剂盒（天根，北京）制备每一头水牛个体的基因组DNA。利用Nano化OP2000和 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA样本质控； 4)SSR引物扩增：根据上述筛选的SSR引物，针对上述35头水牛个体基因组DNA 进行PCR扩增。PCR扩增体系（20. 0yL)为；DNA模板1. 0yL，引物混合物1. 0yL，Premix Thq10.OuL，双蒸水8.OyL.PCR反应程序为；95°C预变性3分钟；95°C变性30秒，58°C~ 60°C退火30秒，72°C延伸30秒，循环35次；72°C延伸8分钟； 5)SSR扩增产物检测及片段大小判读；针对每一份PCR产物取10. 0yL，W1 ;3的 比例加入双蒸水进行稀释。根据HTDNA5KReagentKit(Perki址lmer，USA)的操作说明 进行上机前的胶、Marker和Ladder等试剂的灌注，之后利用L油化ipGX生物大分子分析 仪（Perki址lmer，USA)检测PCR产物并判读片段大小； 6)沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析；采用化werMarker3. 25软件分析35头 水牛个体的等位基因数（Na)、期望杂合度（He)、观察杂合度（H。）和多态性信息含量（PIC)等 遗传参数信息，同时计算出Nei遗传距离参数；WUPGMA算法对供试材料进行聚类分析。 本专利技术的优点；本专利技术方法具有高效、便捷、准确且成本低廉等优势，利用本专利技术 可为水牛分子标记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定 位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。【附图说明】 图1为本专利技术实施例2中沼泽型水牛SSR密度分布图。 图2为本专利技术实施例2中沼泽型水牛SSR重复单元类型和数量。 图3为本专利技术实施例2中沼泽型水牛SSR引物扩增情况。 图4为本专利技术实施例3中7个水牛品种的聚类分析图【具体实施方式】 下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明。 实施例1沼泽型水牛化igene序列获得及SSR引物设计 一、沼泽型水牛化igene序列获得 1、RNA样本制备；屠宰沼泽型母水牛和公牛各1头，采集屯、、脑、肺、肾脏、脂肪、肝 脏、脾脏、子宫、卵巢、睾丸和乳腺11个组织，立即置于液氮里，速冻后置于-80°C超低温冰 箱保存。采用Trizol试剂分别提取各组织样本总RNA，取每个样本1. 5yg，构建一个总量 为16. 5yg的样本混合池。 2、cDNA建库；WDynabeadsmRNADIRECTKitQnvitrogen，USA)从总RNA中抽 提mRNA，mRNA总量大于lOOng是可W正常建库（200ngW内），利用物理法打断mRNA样本， W随机引物反转录合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaquickPCR试剂盒纯化并加邸缓冲液洗脱之后做末端修 复、加A并连接测序接头，连接产物纯化回收后做PCR扩增，PCR产物W2 %琼脂糖凝胶电泳 分离，切胶选择400~5(K)bp目的条带，胶回本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沼泽型水牛SSR引物，其特征在于：所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1～138所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓廷贤，梁贤威，庞春英，谭正准，朱鹏，陆杏蓉，段安琴，黄健，李辉，陈明棠，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45