转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用。所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的美国孟山都公司转基因苜蓿草品系J163，在转基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV（启动子）与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区设计一组特异性引物，以BstDNA聚合酶启动环介导等温扩增,成功建立了苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法，操作简单，特异性强，灵敏度高，检测最低拷贝数为10，能够快速、准确地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析和鉴定。

【技术实现步骤摘要】
转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草J163品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)检测引物及检测方法和应用。
技术介绍
转基因苜蓿草J163品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前还未获得我国转基因生物安全证书，尚未批准其进口。苜蓿草是美国继玉米、小麦、大豆后第四大农作物，因其蛋白含量约占总干草质量的17％～20％，与其他豆科牧草相比是一种极好的饲料作物。转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物进口安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品基于核酸基础上的检测可以分为4种检测策略:1)筛查法:对转基因产品中的启动子中的启动子、终止子等通用基因进行筛查；2)基因特异性检测：对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3)构建特异性检测：对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4)品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。由于启动子、终止子、目的基因可以有多种组合关系，同一组合转化同一植物也可产生不同转化事件，因此筛查法、基因特异性检测和构建特异性检测具有局限性，不能完全满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。而品系特异性/转化事件是指某个外源基因表达框(或片段)插入到宿主基因组某个位置而形成的稳定遗传转化。因此转化事件一旦发生就具有唯一性，针对转化事件的检测可以起到身份识别的作用。目前，国内转基因苜蓿草检测策略大多采用检测启动子、终止子或EPSPS基因等筛查检测从而确定是否转基因苜蓿草，但对于不同品系的转基因苜蓿草不能进行鉴别性检测，无法满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。2000年，Notomi等开发了环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)，酶在62℃左右进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的诊断。扩增完成后，加入特殊的染料，可通过肉眼判定结果，可以实现可视化的检测。但是，针对不同的检测对象，引物的筛选以及针对性的扩增和检测条件是获得高灵敏度、高特异性结果的关键，对于同一种检测对象，采用不同的引物组合，其检测结果也相差甚远。目前未见到有转基因苜蓿草J163该作物品系特异性LAMP可视化检测方法相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草采用的筛查检测技术不能准确地检测具体的转基因品系的不足，提供一组转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测用引物，该组引物具有高特异性和灵敏度，基于所述引物及其组合，本专利技术可成功建立转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP可视化检测方法。本专利技术要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP可视化检测方法。本专利技术还一要解决的技术问题是提供所述检测方法的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV(启动子)与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，设计得到一组共6条特异性的引物。并确定了精确地检测步骤和条件，建立特异性强、灵敏度高的转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法。具体地，提供一组转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测用引物F3，B3，FIP，BIP，LF和LB，其序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示：SEQIDNO.1:F3:5’-CTTCTTTGCCGGGACAAG-3’。SEQIDNO.2:B3:5’-CATGTGCTGGAACAGTAGTT-3’。SEQIDNO.3:FIP:5’-AATTAGCTTCCACTCGAGCAGGAACTGAAGTGTTCGGTGG-3’。SEQIDNO.4:BIP:5’-AAAGCCTCAACAAGGTCAGGGTTCTTCATTGATCTCCTGTAGC-3’。SEQIDNO.5:LF:5’-ACCTGCAGAAGCTTGATGG-3’。SEQIDNO.6:LB:5’-GAGTCTCCAAACCATTAGCCA-3’。本专利技术同时提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用所述引物F3，B3，FIP，BIP，LF和LB，进行LAMP可视化检测；其中，S2所述LAMP检测的反应体系为25μL：10×Thermopolbuffer2.5μL、F3和B3各0.5μL(10μM)、FIP和BIP各1μL(40μM)、LF和LB各0.5μL(40μM)、dNTPs4μL(10mM)、MgSO41μL(100mM)、BstDNApolymerase1μL(8U/μL)、TemplateDNA1μL和11.5μLddH2O。优选地，S2所述检测的反应程序为：63℃恒温反应60min，85℃加热2min使酶失活，反应即结束。优选地，S2所述实时荧光PCR检测反应体系中MgSO4终浓度为2mM。根据检测结果进行判断的方法可以采用以下两种方法的其中之一：方法一：根据颜色变化进行结果判断：向反应终体系加入0.2μLSYBRgreenI，1min观察结果，阳性反应呈现黄绿色，而阴性的反应保持橙色；方法二：电泳检测判断：根据LAMP法扩增的产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA，因此阳性反应的产物经过1.5％琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。本专利技术同时提供所述转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法的应用，应用于鉴别转基因苜蓿草J163品系与其他作物。尤其是与转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系BT11、转基因大米cryIA(a/b)、非转基因油菜籽、非转基因小麦、非转基因大叶苜蓿的检测鉴别方面。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术根据转基因苜蓿草J163品系的5’端启动子(P-eFMV)与内源苜蓿草基因组DNA邻接区序列，设计了J163品系特异性的LAMP检测用引物，外引物F3和B3覆盖了邻接区区域，可以实现对J163进行品系特异性鉴别。本专利技术筛选的设计和筛选的引物，首次实现采用LAMP方法对J163进行品系特异性的鉴定。本专利技术首次提供了一组共6条引物，该组引物对邻接区序列的6个特异序列区的识别，保证了本专利技术检测方法LAMP扩增的高度特异性；本专利技术设计的环引物使得扩增效率进一步大大提高，耗时短，在1h内可实现对J163品系的鉴定。三.本专利技术的扩增体系均在等温条件下采用特异性酶进行扩增，对实验仪器要求低，检测成本低；通过加入显本文档来自技高网...

【技术保护点】
组转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物，其特征在于，所述引物为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一组转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物组，其特征在于，所述引物组的引物为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。2.权利要求1所述转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测用引物组在鉴别转基因苜蓿草J163品系方面的应用。3.一种转基因苜蓿草J163品系特异性环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用权利要求1所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB进行LAMP检测，根据检测结果进行判断；其中，S2所述环介导等温扩增检测的反应体系为25μL：10×Thermopolbuffer2.5μL、10μM的F3和10μM的B3各0.5μL、40...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋湘，刘二龙，卢丽，吕英姿，樊武疆，姚柏辉，王定国，苏彩珠，林惠娇，唐婕，郑高彬，林学勤，符其娇，秦焯敏，
申请(专利权)人：中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44