转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明专利技术针对转基因甜菜GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列设计引物和探针，建立转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，扩增效率为101％，最低定量检测下限为16copies。有效的解决了现有技术中无转基因甜菜GTSB77品系特异性精准定量检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫、国内农业产品食品监管的转基因甜菜GTSB77及其产品的检测。

【技术实现步骤摘要】
转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒
：本专利技术属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
技术介绍
：目前上市的转基因甜菜品系共有三个：GTSB77、T120-7和H7-1，其中H7-1已获得我国农业部批准用于饲料。转基因甜菜GTSB77是由诺华公司和孟山都公司通过农杆菌介导法将导入甜菜，研发出具抗草甘膦除草剂抗性的甜菜品系，商品名为：InVigorTMsugarbeet。1998年-2004年间，美国、日本、加拿大、澳大利亚、菲律宾相继批准甜菜GTSB77品系作为食品或饲料用途，中国尚未批准转基因甜菜GTSB77批准用于食品和饲料。目前美国和加拿大95％以上种植的甜菜均为转基因甜菜。GTSB77(Glyphosate-tolerantsugarbeetline77)由转入三个基因研发而成：cp4-epsps基因、uidA基因和修饰过的gox基因。cp4-epsps基因和gox基因均为草甘膦除草剂耐受基因(cp4-epsps基因编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶对草甘膦除草剂不敏感；gox基因编码草甘膦氧化还原酶而降解除草剂，然而由于其在翻译过程中被截断，其序列69％与甜菜基因融合形成嵌合基因，尽管嵌合基因序列能进行mRNA转录，但没有新的蛋白翻译产生，因此转基因甜菜GTSB77没有GOX酶活性。)。目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specificPCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(ScreeningPCR)、基因特异性PCR(Gene-specificPCR)、构建特异性PCR(Construct-specificPCR)具有更加高的具有高特异性，甚至能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因甜菜GTSB77品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。目前欧盟等其他国家和地区均尚无转基因甜菜GTSB77品系特异性定量检测方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因甜菜GTSB77品系的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本专利技术的第一个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’(如SEQIDNO.1所示)；GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’(如SEQIDNO.2所示)。本专利技术的第二个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’(如SEQIDNO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。所述的荧光报告基团优选为FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。本专利技术的第三个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’(如SEQIDNO.1所示)；GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’(如SEQIDNO.2所示)；所述的检测探针如下所示：GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’(如SEQIDNO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。本专利技术的第四个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的基因组DNA作为模板；(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系。优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括PremixExTaqTM12.5μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，10μmol/L检测引物GTSB77-F和GTSB77-R各0.5μL，10μmol/L检测探针GTSB77-P0.5μL，DNA模板2μL和ddH2O8.8μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因甜菜GTSB77品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因甜菜GTSB77品系。本专利技术的第五个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取转基因甜菜GTSB77品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线；(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因甜菜GTSB77品系基因组DNA的含量(拷贝数或质量)。本专利技术针对转基因甜菜GTSB77品系特异性序列(GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列)设计引物和TaqMan探针，建立转基因甜菜GTSB77实时荧光聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本专利技术的方法进行检测发现其定量检测下限为16拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为101％，重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足监管部门和公众对转基因甜菜GTSB7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：GTSB77‑F：5’‑AACGTGGATACCACATCGTGATC‑3’；GTSB77‑R：5’‑GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’；GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’。2.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。4.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’；GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’；所述的检测探针如下所示：GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。5.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的基因组DNA作为模板；(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系。6.根据权利要求5所述的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，卢丽，吕英姿，袁慕云，蒋湘，苏彩珠，李嘉琪，樊武疆，林先准，李培深，吴险峰，陈毅锋，
申请(专利权)人：中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东,44