转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明专利技术针对转基因棉花MON88701品系转入的基因盒5’端与棉花基因组邻接区序列设计检测引物和探针，建立转基因棉花MON88701品系实时荧光PCR检测方法，具有特异性良好，灵敏度高，可重复性良好等优点，扩增效率为94％，最低定量检测下限为34copies。有效的解决了现有技术中无转基因棉花MON88701品系特异性定量检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫、农产品监管中转基因棉花MON88701及其产品的检测。

Transgenic cotton MON88701 strain specific real-time fluorescent PCR detection primer, probe, method and kit

The invention discloses a transgenic cotton MON88701 strain specific real-time fluorescent PCR detection primer, a probe, a method and a kit. According to the invention of gene cassettes of transgenic cotton MON88701 strains into the 5 'end of the cotton genome and sequence design primer and probe for detecting the contiguous zone, the establishment of MON88701 transgenic cotton lines real-time fluorescence PCR detection method has good specificity, high sensitivity, good repeatability and other advantages, the amplification efficiency is 94%, the minimum detection limit for quantitative 34copies. Effective solution to the non transgenic cotton prior MON88701 strain specific quantitative detection technology, the detection method can be applied to the entry and exit of transgenic cotton MON88701 and its products, the port inspection and quarantine supervision of agricultural products.

【技术实现步骤摘要】
转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒
：本专利技术属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
技术介绍
：转基因棉花MON88701是孟山都公司开发的耐受两种广谱除草剂麦草畏和草铵膦的转基因品系。MON88701经由农杆菌介导PV-GHHT6997质粒转入Coker130棉花而成，其T-DNA含有dmo(dicambamono-oxygenase)基因盒和bar(phosphinothricinN-acetyltransferase，PAT)基因盒，分别编码麦草畏单加氧酶和膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)，它们在转基因植株内均为1个拷贝。目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specificPCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(ScreeningPCR)、基因特异性PCR(Gene-specificPCR)、构建特异性PCR(Construct-specificPCR)具有更加高的具有高特异性，能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因棉花MON88701品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因棉花MON88701品系的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本专利技术的第一个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’(如SEQIDNO.1所示)；MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’(如SEQIDNO.2所示)。本专利技术的第二个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’(如SEQIDNO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述的荧光报告基团优选为FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。本专利技术的第三个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’(如SEQIDNO.1所示)；MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’(如SEQIDNO.2所示)；所述的检测探针如下所示：MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’(如SEQIDNO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。本专利技术的第四个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的基因组DNA作为模板；(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系。优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括PremixExTaqTM12.5μL，ROXReferenceDyeII0.2μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.4μL，10μmol/L检测探针MON88701-P0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O8.7μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环，于58℃收集荧光信号。优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因棉花MON88701品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因棉花MON88701品系。本专利技术的第五个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取转基因棉花MON88701品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因棉花MON88701品系的标准曲线；(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因棉花MON88701品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因棉花MON88701品系基因组DNA的含量(拷贝数或质量)。本专利技术具有以下优点及有益效果：1.本专利技术打破国外其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；2.本专利技术弥补和完善了我国转基因产品定量检测技术体系。提供的技术用于转基因产品的检测可更加好的保护消费者的知情权和选择权，满足国家监管部门对转基因产品的鉴定和标识需求。3.本专利技术针对转基因棉花MON88701品系特异性序列设计引物和TaqMan探针，建立转基因棉花MON88701实时荧光聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本专利技术的方法定量检测下限为34copies，建立的转基因棉花MON88701品系的标准曲线方程为：y＝-3.48x+39.91，R2为0.99，扩增效率：94％(介于90％～110％)，表明本专利技术的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法在模板量34-680000copies重复性实验显示本专利技术的方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强。附图说明：图1是退火温度为58℃时扩增图。图2是退火温度为60℃时扩增图。图3是转基因棉花MON88701品系特异性检测方法特异性实验结果；1为Adhc-MON88701质粒；2～14分别为转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON88701‑F：5’‑GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC‑3’；MON88701‑R：5’‑TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’；MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’。2.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。3.根据权利要求2所述的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。4.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’；MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’；所述的检测探针如下所示：MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。5.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的基因组DNA作为模板；(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系。6.根据权利要求5所述的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，卢丽，吕英姿，袁慕云，蒋湘，李嘉琪，苏彩珠，樊武疆，林先准，李培深，吴险峰，
申请(专利权)人：中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东,44