一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法，包括以下组分：DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合物、低温冻干保护剂，具体步骤如下：将DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合物混合在一起，制备得到PCR反应体系混合液，再将PCR反应体系混合液与低温冻干保护剂混合均匀；将混匀后的液体放入冷冻干燥箱中，进行预冻3‑5h；在‑45℃—‑55℃的条件下，进一步升华，保持冷冻干燥2‑4h；重复步骤三两次，得到最终的PCR扩增冻干预存试剂；将PCR扩增冻干预存试剂分装进96孔板反应管中，使用时加ddH2O稀释即可。本发明专利技术具有运输方便、稳定性好等优点。

PCR amplification freeze interference storage reagent and preparation method thereof

The invention discloses a frozen storage intervention PCR amplification reagent and preparation method thereof, which comprises the following components: DNA, dNTP, Mg2+ polymerase, a mixture of low temperature freeze-drying protective agent, the specific steps are as follows: DNA, Mg2+, dNTP polymerase mixture mixed together, prepared by PCR reaction system of the mixture, then PCR reaction mixture and freeze drying protective agent mixed evenly; the evenly mixed liquid into the freezing drying box, pre freezing 3 5h; further sublimation in 45 C and 55 C conditions, keep 2 4H freeze drying; repeat step 32 times to obtain the final PCR amplification frozen storage intervention reagent; the PCR was divided into 96 deposit freeze intervention reagent plate in the reaction tube, when used with ddH2O to dilute. The invention has the advantages of convenient transportation, good stability and the like.

【技术实现步骤摘要】
一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体来说是一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有快速、简便、灵敏、特异的优点,PCR技术广泛应用于基因克隆、突变检测和疾病筛查，为科学研究及临床诊断方面带来了革命性的进展。DNA扩增是一段特定的DNA序列拷贝数增加的过程，可发生在体内或体外,体外扩增可通过聚合酶链反应获得，DNA模板和引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，以目标DNA序列为模板，按5’→3’方向，根据碱基配对和半保留复制原则，经过多次循环的变性-退火-延伸的过程，将目标DNA片段进行几百万倍的复制扩增,DNA的扩增优点是特异性高、灵敏度高、成本低廉、操作简单、设备要求简单。RNA扩增即逆转录PCR，是将RNA的反转率(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术,以RNA为模板经过反转录酶的作用从RNA合成cDNA后，再以cDNA为模板，经过PCR反应，对目标RNA进行复制扩增,通过将发反转录和PCR技术项结合，实现了RNA的复制和扩增，操作简单、扩增效率高、灵敏度高、特异性强。核酸诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态或缺陷，从核酸结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法,核酸诊断是通过互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交,这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它既能在DNA和DNA之间进行也能够在DNA和RNA之间进行,用一段已知的序列作为探针，与单链DNA结合，两者碱基能够完全配对，即为互补结合，则说明待测DNA中含有已知序列,核酸诊断广泛用于各种病原体检测，但是运输不便，操作复杂，对实验者技术要求较高，污染的可能性大，目前市场缺少能在4℃或常温保存的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的运输不便、操作复杂、存在污染性的缺陷，而提供一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法。本专利技术解决上述技术问题提供的技术方案是：本专利技术公开了一种PCR扩增冻干预存试剂，包括以下组分：DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、低温冻干保护剂。作为优选，所述的DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，所述的Mg2+的浓度为4mM，所述的dNTP的浓度为0.4mM，所述的低温冻干保护剂的浓度为1.2-7mM。作为优选，所述的低温冻干保护剂由以下组分组成：海藻糖4-25g、甘露糖醇1-7g、牛血清白蛋白1-7g、吐温0.1-0.25ml、Tris-HCl2.5-5.0mmol、水49-50ml。作为优选，本专利技术还公开了上述PCR扩增冻干预存试剂的制备方法,具体步骤如下：一、将DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合在一起，制备得到PCR反应体系混合液，再将PCR反应体系混合液与低温冻干保护剂混合均匀；二、将混匀后的液体放入冷冻干燥箱中，进行预冻3-5h；三、在-45℃—-55℃的条件下，进一步升华，保持冷冻干燥2-4h；四、重复步骤三两次，得到最终的PCR扩增冻干预存试剂；五、将PCR扩增冻干预存试剂分装进96孔板反应管中，使用时加ddH2O稀释即可。作为优选，所述的步骤二中，冷冻温度为-45℃—-55℃。作为优选，步骤一中PCR反应体系混合液和低温冻干保护剂按照使用浓度比例为3.3-7.0：12.8-16.5。作为优选，步骤五中96孔板中的每个反应管使用时总反应体积为20μl。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益优点：本专利技术提供了一种用于核酸扩增的预装96孔PCR反应管，具体包括：DNA聚合酶，缓冲液，Mg2+，dNTPs和低温冻干保护剂(海藻糖、甘露糖醇、牛血清白蛋白、吐温、Tris-HCl、水)以及分装使用的96孔PCR反应管，本专利技术提供的PCR扩增冻干预存试剂，使核酸扩增试剂冷冻干燥后能在常温条件下运输，历时3天，对检测效果没影响，节约运输成本；易于保存：冻干体系无需低温冷冻，可于4℃保存6个月，若于-20℃可保存1年；操作容易，检测效果好：使用时仅需加入缓冲剂复溶，再加入待检测的模板，即可进行检测，且灵敏度无损失或损失很小；保护剂组分简单，成本低廉。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明，但本专利技术并不仅限于这些实施例。实施例1一、将DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合在一起，DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，Mg2+的浓度为4mM，dNTP的浓度为0.4mM，得到PCR反应体系混合液，然后将PCR反应体系混合液和低温冻干保护剂按照使用浓度比例按照1:3混匀；低温冻干保护剂组分如下：二、将混匀后的液体放入冷冻干燥箱中，隔板温度为-45—-55℃，进行预冻3-5h；三、进一步升华，保持冷冻干燥2-4h；四、重复步骤三两次，得到最终的PCR扩增冻干预存试剂并分装至8连96孔板中；五、从牛支原体PG45株菌液中提取DNA，稀释浓度至100ng/ul；六、向PCR扩增冻干预存试剂反应管中加入uvrC基因引物F1μl、R1μl,DNA模板1μl，以及15μlddH2O，其中：引物F：5′-GAATTTACGCAAGAGAATGCTTCA-3′引物R:5′-TCAGGCCTTTGCTACAATGAAC-3′；七、将混合后的反应液放入PCR仪中，设置程序如下：冻干保护剂各组分不同含量组成的灵敏度和准确率检测结果如下表a：表a由表a可知，实验组3和4的保护剂浓度较高检测灵敏度受到影响，故选择冻干保护力度大同时保持高灵敏度的实验组2的保护剂组分配比。实施例2以上述实施例1中的实验组2的PCR扩增冻干预存试剂为实验组，实验组在37℃中恒温放置不同时间；以没有经过冻干处理的PCR反应混合试剂为对照组，对照组同样在37℃中恒温放置不同时间；各组分含量如下：DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul、Mg2+浓度为4mM、dNTP浓度为0.4Mm对照组和实验组PCR反应体系如下将混合后的反应液放入PCR仪中，设置程序如下：对照组和实验组灵敏度检测结果如下：对照组在37℃放置3天时检测灵敏度有所下降，放置7天时灵敏度大幅下降几乎无法进行准确的检测，而实验组的放置7天后既然保持高检测灵敏度，说明冻干保护剂对PCR试剂的保护起到很好的效果。上述实施例仅例示性说明本专利技术的原理及其功效，而非用于限制本专利技术。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本专利技术的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
中具有通常知识者在未脱离本专利技术所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本专利技术的权利要求所涵盖。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR扩增冻干预存试剂，其特征在于：包括以下组分：DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、低温冻干保护剂。

【技术特征摘要】
1.一种PCR扩增冻干预存试剂，其特征在于：包括以下组分：DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、低温冻干保护剂。2.根据权利要求1所述的一种PCR扩增冻干预存试剂，其特征在于：所述的DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，所述的Mg2+的浓度为4mM，所述的dNTP的浓度为0.4mM，所述的低温冻干保护剂的浓度为1.2-7mM。3.根据权利要求1所述的一种PCR扩增冻干预存试剂，其特征在于：所述的低温冻干保护剂由以下组分组成：海藻糖4-25g、甘露糖醇1-7g、牛血清白蛋白1-7g、吐温0.1-0.25ml、Tris-HCl2.5-5.0mmol、水49-50ml。4.根据权利要求1-3任一所述的一种PCR扩增冻干预存试剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、将DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合在一起，制备得到PCR反应体系混...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，李静，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34