用于检测肝癌的基因标志物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及用于检测肝癌的基因标志物及其用途。本发明专利技术还涉及使用所述基因标志物对肝癌进行检测的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肝癌的基因标志物及其用途
本专利技术涉及肝癌的临床分子诊断的领域。具体地，本专利技术涉及通过高通量测序检测肝癌基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量从而检测肝癌是否存在的方法和试剂盒。
技术介绍
肝癌是最常见的全球恶性肿瘤之一。据世界卫生组织2008年统计，全球每年新发病748300例，死亡695900例，其中50％以上发生在中国。在原发性肝癌中，70％-85％为肝细胞肝癌(HCC)。目前，肝癌的5年生存率仅3％-5％，因为大部分患者就诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时间。因此，早检查早诊断早治疗是提高患者生存质量、延长生存期的关键。目前肝癌的检测主要通过影像学、组织活检、血清学检测等。然而，影像学易受操作者经验影响，并且依赖于设备，费用昂贵，尤其是在医疗资源有限的情况下，其准确率难以保证，难以广泛和常规应用。组织活检是目前临床上确诊肝癌的金标准，但组织活检存在很大局限性，例如手术取样的困难，或者某些癌症部位不便进行穿刺，并且穿刺本身也会带来一定的临床风险，反复穿刺筛查更会给患者带来巨大痛苦。血清学检测目前应用最广的是对甲胎蛋白(AFP)的检测，但AFP对早期肝癌的灵敏度和特异性都不高，例如在一些非肝癌的慢性肝病患者，如很多慢性肝炎和肝硬化患者中，血清AFP也升高。在对肝癌的早期筛查中，难度最大的是对小肝癌的筛查。小肝癌又称为亚临床肝癌或早期肝癌，临床上无明显肝癌症状和体征，一般指肝细胞癌中单个癌结节最大直径不超过3厘米或两个癌结节直径之和不超过3厘米的肝癌。我国的小肝癌标准是：单个癌结节最大直径不超过3厘米；多个癌结节数目不超过两个，其最大直径总和应小于3厘米。小肝癌的手术切除率高达93.6％，预后较好，生存率较高。因此早期筛查出小肝癌具有重要的临床意义。目前对小肝癌的筛查也主要采取超声检查、影像学诊断与血清甲胎蛋白检测等方法。但如上所述，这些传统方法对于小肝癌诊断的准确率和特异性不高。因此，寻找新的肝癌标志物，尤其是预警监测和早期诊断的标志物是对于提高早期肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
技术实现思路
专利技术人通过对正常样品和肝癌样品进行高通量测序，并对其中各基因上的5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)含量进行分析，出乎意料地发现了多个极具信息的可用于检测肝癌的基因标志物。因此，本专利技术的第一个方面涉及用于检测肝癌的基因标志物，包括一个或多个选自以下的基因：FAT非典型钙粘蛋白1(FAT1)、雌激素相关受体γ(ESRRG)、γ氨基丁酸A类受体β3亚基(GABRB3)、TNF受体超家族成员11b(TNFRSF11B)、受体互作丝氨酸/苏氨酸激酶4(RIPK4)、重排的L-myc融合蛋白(RLF)、溶质载体家族13成员5(SLC13A5)、细胞色素P450氧化还原酶(POR)和DeltexE3泛素连接酶(DTX1)。优选的，所述基因标志物包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个选自以下的基因：FAT1、ESRRG、GABRB3、TNFRSF11B、RIPK4、RLF、SLC13A5、POR和DTX1。更优选的，所述基因标志物包括FAT1、ESRRG、GABRB3、TNFRSF11B、RIPK4、RLF、SLC13A5、POR和DTX1。本专利技术还涉及上述基因标志物在检测肝癌中的用途。本专利技术的第二个方面涉及用于检测肝癌的方法，包括以下步骤：(a)测定正常样品和受试者样品中本专利技术所述的基因标志物的5-hmC的含量；(b)用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化；(c)对经标准化的所述基因标志物的5-hmC含量进行数学关联，并获得评分；和(d)根据所述评分获得检测结果，评分P大于0.5表明该受试者样品患有肝癌。在一个实施方案中，所述样品是受试者或正常人体液中游离的DNA片段，或来源于细胞器、细胞以及组织中的完整基因组DNA。其中，体液是血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。在一个实施方案中，本专利技术所述的基因标志物的5-hmC含量可通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性内切酶法、化学标记法、与高通量测序方法联用的沉淀法、单分子实时测序法(SMRT)、氧化重亚硫酸盐测序法(OxBS-Seq)等。葡糖基化法的原理是采用T4噬菌体β-葡萄糖转移酶(β-GT)，在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下，将葡萄糖转移至羟基位置，从而生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同时可采用同位素标记底物进行定量。在葡糖基化法基础上进一步发展出限制性内切酶法和化学标记法。限制性内切酶法的原理是：葡糖基化反应改变了一些限制性内切酶的酶切特性。甲基化依赖的限制性内切酶MspI和HpaII可识别同样的序列(CCGG)，但它们对甲基化状态的敏感性是不同：MspI识别并切割5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-hmC，但不能切割5-ghmC；HpaII只切割完全未修饰的位点，胞嘧啶上的任何修饰(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻碍切割。若CpG位点含有5-hmC，那么糖基化、酶解之后能检测到条带，未糖基化对照反应中没有条带；同时可采用qPCR进行定量分析。另外，其他限制性内切酶也同样存在阻碍5-ghmC酶切的情况，可应用于5-hmC检测(如：GmrSD，MspJI，PvuRtslI，TaqI等)。化学标记法的原理是：将酶反应底物上的葡萄糖进行化学修饰转变成UDP-6-N3-glucose，将6-N3-glucose转移到羟甲基位置，生成N3-5ghmC。随后，通过点击化学方法在每个5-hmC上添加一分子生物素，结合下一代高通量DNA测序技术或单分子测序技术，可分析5-hmC在基因组DNA中的分布情况。沉淀法是将5-hmC用特殊方式修饰后再将其特异性地从基因组DNA中捕获下来，并进行测序分析。氧化重亚硫酸盐测序法是首个以单碱基分辨率对5-hmC进行定量测序的方法.首先将5-hmC进行KRuO4氧化处理，生成5-甲酰胞嘧啶(5fC)，然后采用重亚硫酸盐测序。在此过程中，5-hmC先氧化为5fC，而后脱氨形成U。通常，同时采用多种检测方法对5-hmC进行定量检测。在本专利技术的一个实施方案中，利用化学标记法结合高通量测序来测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量。在该具体的实施方案中，测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量的方法包括以下步骤：将来自肝癌患者和正常人的样品的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接产物；通过标记反应对连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶进行标记；富集含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段，获得富集产物；对富集产物进行PCR扩增，获得测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序结果；根据测序结果确定5-羟甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，标记反应包括：i)利用糖基转移酶将带有修饰基团的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，和ii)将直接或间接连有生物素的点击化学底物与带有修饰基团的5-羟甲基胞嘧啶反应。其中，步骤i)和步骤ii)可以按顺序进行，也可以在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测肝癌的基因标志物，包括一个或多个选自以下的基因：FAT非典型钙粘蛋白1(FAT1)、雌激素相关受体γ(ESRRG)、γ氨基丁酸A类受体β3亚基(GABRB3)、TNF受体超家族成员11b(TNFRSF11B)、受体互作丝氨酸/苏氨酸激酶4(RIPK4)、重排的L‑myc融合蛋白(RLF)、溶质载体家族13成员5(SLC13A5)、细胞色素P450氧化还原酶(POR)和Deltex E3泛素连接酶(DTX1)。

【技术特征摘要】
1.用于检测肝癌的基因标志物，包括一个或多个选自以下的基因：FAT非典型钙粘蛋白1(FAT1)、雌激素相关受体γ(ESRRG)、γ氨基丁酸A类受体β3亚基(GABRB3)、TNF受体超家族成员11b(TNFRSF11B)、受体互作丝氨酸/苏氨酸激酶4(RIPK4)、重排的L-myc融合蛋白(RLF)、溶质载体家族13成员5(SLC13A5)、细胞色素P450氧化还原酶(POR)和DeltexE3泛素连接酶(DTX1)。2.权利要求1所述的基因标志物，包括FAT1、ESRRG、GABRB3、TNFRSF11B、RIPK4、RLF、SLC13A5、POR和DTX1。3.权利要求1或2所述的基因标志物在用于检测肝癌的方法中的用途。4.一种用于检测肝癌的方法，包括以下步骤：(a)测定正常样品和受试者样品中权利要求1或2所述的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的含量；(b)用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆星宇，宋艳群，彭莱，
申请(专利权)人：上海易毕恩基因科技有限公司，上海易毕恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31