检测黄杉大小蠹的引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了检测黄杉大小蠹的引物、试剂盒以及检测方法。该检测方法为巢式PCR，所用的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了包括上述引物的检测黄杉大小蠹的试剂盒。本发明专利技术的检测方法及其试剂盒具有操作简单、准确可靠、检测时间短以及特异性良好等优点，能够将黄杉大小蠹与其他小蠹区分开来，检测限为20pg。

【技术实现步骤摘要】
检测黄杉大小蠹的引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地，涉及检测黄杉大小蠹的引物、试剂盒以及检测方法。
技术介绍
黄杉大小蠹(DendroctonuspseudotsugaeHopkins.)是近年来口岸截获频次最多的大小蠹，严重危害了森林和木材资源。近年来，大量入境的木材、木制品和木包装中携带的木材害虫极为复杂，常见的有天牛、小蠹、长蠹、吉丁、象甲等。其中，小蠹因其疫情复杂加之成虫体小(常不足9mm)，导致其快速鉴定十分困难，目前口岸能够鉴定到种的不足12％。据统计，黄杉大小蠹的截获频次占大小蠹截获总频次的36.31％，比居第二频次的云杉大小蠹要高出29.3％。为了有效防控外来有害生物，首先要在口岸现场查验中对其进行准确而快速的鉴定。如何有的放矢地截获和判断黄杉大小蠹疫情，提高检疫的针对性和有效性，保护我国林业的生产安全和生态安全，解决黄杉大小蠹的快速鉴定工作显得尤为重要。目前国内外针对于黄杉大小蠹的研究较少，并且主要集中在成虫形态学方面，同时国内外针对黄杉大小蠹的鉴定主要通过成虫形态学方法，该方法需要专业的昆虫分类学知识，对人员要求较高，大量入境的木材、木制品和木包装中携带的黄杉大小蠹虫态复杂，成虫形态学研究难以应付，且口岸检疫时要求通关速度快，无法将卵、幼虫进行饲养至成虫后再鉴定。DNA条形码技术是利用生物本身普遍具有的一段保守性适中，容易获得的基因片段作为标准、建立在现代先进的DNA扩增、测序和比对技术基础之上的一种物种鉴定手段。与传统的形态鉴定相比，利用DNA条形码进行物种鉴定具有以下优势：对物种的鉴定将不再受物种发育状态的限制，克服了卵、幼虫、蛹等无法直接鉴定的缺点；对鉴定者的经验和专业背景知识大大降低，减少主观判断的干扰，物种的鉴定更加准确快速。近年来，利用分子技术对物种进行鉴定和系统发生关系研究已经成为一种快速有效的方法，其中线粒体基因5’端序列具有物种种间遗传距离大，物种种内序列保守、序列两端有保守序列可设计通用引物等特点成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想基因。基于昆虫线粒体COI基因片段的快速鉴定方法近几年广泛应用，鳞翅目、膜翅目、鞘翅目昆虫的快速检测试剂盒也层出不穷，有效地补充了形态分类的不足之处。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术要解决的技术问题是如何有效地鉴别黄杉大小蠹。(二)技术方案为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述问题，本专利技术提供了一种用于检测黄杉大小蠹的引物，该引物包括特异性引物对，其核苷酸序列为：正向引物：5’-AGCCCCAAGGATAGATGA-3’，如SEQIDNO.1所示；反向引物：5’-AGGAATCCCAGGAAGACT-3’，如SEQIDNO.2所示。本专利技术对黄杉大小蠹的mtDNACOI基因与NCBI上公布的其他昆虫mtDNACOI基因序列进行比对和筛选，发现黄杉大小蠹的mtDNACOI基因种间同源性可达99％以上，与其他昆虫的mtDNACOI基因差异大，因此可证明该片段对黄杉大小蠹具有特异性，可以很好的区分黄杉大小蠹与其他种属昆虫。在本专利技术一个优选实施方式中，为了能更好地扩增COI基因以及高效地检测黄杉大小蠹，在用于检测黄杉大小蠹的引物中还包括通用引物，通用引物的核苷酸序列优选为：LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，如SEQIDNO.3所示；HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种含有上述引物的试剂盒。本专利技术还提供了一种含有上述引物的检测试剂。进一步地，试剂盒或检测试剂中还包括Taq酶、PCRBuffer和dNTPMixture。该试剂盒或检测试剂包括用于检测黄杉大小蠹的引物，通过引物，能够高效地检测黄杉大小蠹。本专利技术还提供了一种检测黄杉大小蠹的方法，包括：(1)提取样品DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增反应，其中，正向引物：5’-AGCCCCAAGGATAGATGA-3’，如SEQIDNO.1所示；反向引物：5’-AGGAATCCCAGGAAGACT-3’，如SEQIDNO.2所示；(3)分析PCR产物。该检测方法为巢式PCR法。进一步地，为了能更好地扩增COI基因，步骤(2)具体为：(21)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用通用引物进行第一轮PCR扩增，扩增目的条带为650-750bp，优选700bp；(22)以第一轮PCR扩增产物按1:50～100稀释后的产物为模板，利用正向引物和反向引物进行第二轮PCR扩增；其中，通用引物为LCO1490和HCO2198；正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。在本专利技术一个优选实施方式中，步骤(21)中，PCR反应体系为：以25μL计为：0.125μLTaq酶、2.5μL10×PCRBuffer、2μLdNTPMixture、1μLDNA、1μL引物LCO1490、1μL引物HCO2198和17.375μL灭菌去离子水。进一步地，在该步骤(21)中，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸5min。在本专利技术一个优选实施方式中，步骤(22)中，PCR反应体系为：以25μL计为：0.125μLTaq酶、2.5μL10×PCRBuffer、2μLdNTPMixture、1μLDNA、1μL正向引物、1μL反向引物和17.375μL灭菌去离子水。进一步地，在该步骤(22)中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min。其中，在步骤(22)中，扩增比例优选为1:50。在本专利技术一个优选实施方式中，步骤(3)为：当PCR产物扩增的条带大小为343bp，则结果为阳性。本专利技术还提供了上述检测黄杉大小蠹的方法在植物保护中的应用。本专利技术运用分子生物学技术可以有效地解决黄杉大小蠹在口岸现场截获中虫态不一难以鉴别的问题，并且根据实验所测得的线粒体DNACOI序列设计并筛选了一对黄杉大小蠹的特异性引物，通过实时荧光PCR实验对其特异性和灵敏度进行了进一步的验证，实验中设计的黄杉大小蠹特异性引物能够特异地将黄杉大小蠹与其他小蠹区分开，其中黄杉大小蠹的检测限为20pg，而其他五种小蠹在20ng时仍不能扩增，说明该引物对黄杉大小蠹的灵敏度至少比其他物种小蠹要高1000倍，特异性良好。附图说明图1为本专利技术实施例中琼脂糖凝胶电泳对五种小蠹第一轮PCR扩增产物的检测图；其中，泳道：1:美松齿小蠹；2:落叶松八齿小蠹；3:北方瘤小蠹；4:黄杉大小蠹；5:松十二齿小蠹；CK:阴性对照；M:DL2000Marker(100,250,500,750,1000,2000bp)；图2为本专利技术琼脂糖凝胶电泳对五种小蠹50℃第二轮PCR扩增产物的检测图；其中，泳道：1:美松齿小蠹；2:落叶松八齿小蠹；3:北方瘤小蠹；4:黄杉大小蠹；5:松十二齿小蠹；CK:阴性对照；M:DL2000Marker(100,250,500,750,10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测黄杉大小蠹的引物，其特征在于，包括：正向引物：5’‑AGCCCCAAGGATAGATGA‑3’；反向引物：5’‑AGGAATCCCAGGAAGACT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄杉大小蠹的引物，其特征在于，包括：正向引物：5’-AGCCCCAAGGATAGATGA-3’；反向引物：5’-AGGAATCCCAGGAAGACT-3’。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括一对通用引物：LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3；HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。3.含有权利要求1或2所述引物的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括Taq酶、PCRBuffer和dNTPMixture。5.一种检测黄杉大小蠹的方法，其特征在于，包括：(1)提取样品DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的正向引物和反向引物进行PCR扩增反应；(3)分析PCR产物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：(21)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的通用引物进行第一轮PCR扩增，扩增目的条带为650-750bp；...

【专利技术属性】
技术研发人员：石娟，邬颖，陈芳，王子楠，李建光，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11