浙江道地性白术的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种浙江道地性白术的鉴定方法，包括DNA提取，还包括以下步骤：1)、PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55‑59℃；2)、将扩增产物直接进行HRM，HRM程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃；收集65‑95℃的荧光信号数据，获得高分辨率熔解曲线；当熔解曲线满足Tm值92℃出现单峰曲线形状时，判定是浙白术。

【技术实现步骤摘要】
浙江道地性白术的鉴定方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种应用高分辨率熔解曲线技术鉴定浙白术道地性的方法。
技术介绍
白术，属菊科、苍术属多年生草本植物，以根茎入药，具有多项药用功能。主要分布于浙江、湖北、四川、云南、贵州等山区湿地。其拉丁学名Atractylodesmacrocephala。属于菊科、苍术属多年生草本植物。喜凉爽气候，以根茎入药，具有多项药用功能。浙江白术是著名的“浙八味”之一，四川、安徽、湖北等地也有栽培；白术存在多种形态结构相似、特征相近的近缘种。再加之市场中药材复杂混乱，存在大量代用品和混伪品，因此仅仅依靠主观性强的传统鉴别中药材的方法难以精准区分。传统鉴别中药材的方法难以精准区分白术与其混伪品。DNA条形码技术在2003年被首次提出，并且迅速在物种的分类与鉴定研究领域中得到广泛的关注和应用。它是一种新型物种分子鉴定技术。该技术可以利用短的、标准的DNA序列片段作为物种标记，定位亲缘关系，分析分支来源，为中药材提供快速、精准的鉴定。它弥补了传统鉴定方法的缺陷，并具有自身独特的优势，例如准确性高、稳定性好、操作简便等。由于核基因ITS2具有很强的物种水平鉴定能力和良好的PCR扩增效率，因此适合作为植物DNA条形码的序列。ITS2区域可以潜在地用作标准DNA条形码识别药用植物及其近缘种，并且可以作为一个新的通用条码来更广泛地识别植物类群。《白术和苍术的鉴定研究》一文中研究采用ITS2序列对药材白术与苍术进行DNA条形码鉴定。结果白术与苍术的3个基原物种(苍术、关苍术和朝鲜苍术)ITS2序列均为229bp。13条白术的序列仅在98bp处有C-G变异，该方法告知ITS2序列在药材白术与苍术鉴定方具有很好的鉴别效果。专利技术人在前期的研究中发现，13种白术的序列在41bp和98bp处有C-G变异，83bp和187bp处有A-G变异，平均GC含量为69.42％；白术不同基原与其易混伪品的种间比对共有151个序列位点变异。从聚类分析的结果看，ITS2序列不能完全区分白术不同基原植物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速精准鉴定道地性浙白术的检测方法，本专利技术采用高分辨率熔解曲线分析技术检测ITS2序列，分析熔解曲线特征及差异能够有效准确地鉴定浙江白术道地性。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种快速精准鉴定道地性浙白术的检测方法，包括DNA提取，还包括以下内容：1)、PCR扩增PCR扩增体系为：扩增体系中所用的ITS2的引物序列：引物F(ITS2-F)：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；引物R(ITS3-R)：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。PCR扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55-59℃(最佳退火温度为57℃)；Green-2-GoMastermix，即为Green-2-GoqPCRMastermix-LowROX(2x)；2)、40个循环后进入HRM程序，即，将扩增产物直接进行HRM。HRM程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃；收集65-95℃的荧光信号数据，获得高分辨率熔解曲线；当熔解曲线满足Tm值92℃出现单峰曲线形状时，判定是浙白术。备注说明：荧光信号值是荧光定量PCR仪收集到的荧光信号经过荧光定量PCR仪上的软件分析获得的一个相对值，实验中有一个内标。本专利技术所用数据分析方法为熔解温度峰值法，依据Tm值分型，纵坐标为荧光信号相对值对温度的一阶导数。作为本专利技术技术方案的改进：所述步骤2)的高分辨率熔解曲线分析，是在RocheLightCyclerTM480Ⅱ荧光定量PCR仪器上进行HRM；所用软件为LightCycler480Ⅱ分析软件。当熔解曲线满足Tm值92℃出现单峰曲线形状时，判定是浙白术，而安徽白术双峰曲线出现在Tm值87℃。作为本专利技术技术方案的改进：本专利技术利用磁珠法深加工产品基因组DNA抽提试剂盒提取白术药材干粉的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度测定。所得DNA浓度为26.45～112.42ng/ul。在本专利技术中，PCR扩增时，白术包括其近缘种的PCR产物长度约在200-400bp之间；PCR产物在不同产地和不同物种间产生差异明显的Tm值；根据HRM曲线出现峰值所在的Tm值差异及曲线形状差异，从而能实现用于区分浙白术。在本专利技术中，还进行过如下的实验：取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5％ug/ulEB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。浙江道地性白术与其他产地的白术具有的条带均具有400bp的条带。浙江白术PCR条带所对应的序列与已报道浙江白术ITS2(KF0212.1)具有99％同源性。因此，仅仅采用PCR扩增不能对浙白术和其他产地的白术进行有效区分。本专利技术在做高分辨率熔解曲线分析时发现不同产区白术表现出了明显的形状和出峰位置的差异，应该是曲线的形状因G-C含量和突变位点不同导致曲线差异。本专利技术以建立ITS2序列高分辨率熔解曲线模型为基础进行物种鉴定，根据ITS2通用引物扩增获得PCR产物的实时熔解曲线形状及Tm值差异区分物种。高分辨率熔解曲线分析：在RocheLightCyclerTM480Ⅱ荧光定量PCR仪器上运行。本专利技术直接获得高分辨率熔解曲线分析，利用熔解温度峰值法建立白术及近缘物种典型曲线模型，根据对应Tm值差异所得导图来区分不同产地的白术居群药材。综上所述，本专利技术采用的技术方案是：以白术药材干粉为材料，提取基因组DNA，利用ITS2序列的通用引物进行荧光定量PCR扩增，利用高分辨率熔解曲线峰值的Tm值差异鉴定道地性浙江白术。扩增得到PCR产物，通过饱和染料对PCR产物的熔解曲线的实时变化的监测进行HRM测定，进行物种鉴定。本专利技术具有如下技术优势：1)、灵敏度高，HRM可区分单碱基突变，能够高灵敏度地鉴定基因多态性分型结果。2)、快速高效，HRM在几十分钟内即可完成反应，能够快速高效鉴定物种。3)、简单直观，根据产物不同Tm熔解曲线形状，能够快速直观地鉴定物种。本专利技术首次建立浙江白术高分辨率熔解曲线模型，利用高分辨率熔解曲线技术针对白术ITS2序列获得不同产区的曲线形状，与传统ITS2作为DNA条码的测序分析方法比较，具有快速直观高效的优点。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为浙江白术及近缘物种鉴定的高分辨率熔解曲线图。A：浙江白术；B：安徽白术；C：河北白术；D，四川白术；图2为浙江白术及近缘物种PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图。M：DNALadder；1-3：浙江白术样品；4-5：安徽白术样品；6-7：河北白术样品；8：四川白术。图3为退火温度50℃时PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图。M：DNALadder；1-3：浙江白术样品；4-5：安徽白术样品；6-7：河北白术样品；8：四川白术。图4为退火温度60℃时PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图；M：DNALadder；1-3：浙江白术样品；4-5：安徽白术样品；6-7：河北白术样品；8：四川白术。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1、一本文档来自技高网...

【技术保护点】
浙江道地性白术的鉴定方法，包括DNA提取，其特征是还包括以下步骤：1)、PCR扩增：PCR扩增体系：引物F(10μM) 0.2μl引物R(10μM) 0.2μlGreen‑2‑Go Master mix(2×) 5μlDNA 3～15ngRNase free H2O 定容至 10μl；引物F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，引物R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；PCR扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55‑59℃；2)、将扩增产物直接进行HRM：HRM程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃；收集65‑95℃的荧光信号数据，获得高分辨率熔解曲线；当熔解曲线满足Tm值92℃出现单峰曲线形状时，判定是浙白术。

【技术特征摘要】
1.浙江道地性白术的鉴定方法，包括DNA提取，其特征是还包括以下步骤：1)、PCR扩增：PCR扩增体系：引物F(10μM)0.2μl引物R(10μM)0.2μlGreen-2-GoMastermix(2×)5μlDNA3～15ngRNasefreeH2O定容至10μl；引物F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，引物R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；PCR扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，Tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55-59℃；2)、将扩增产物直接进行HRM：HRM程序为：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍宁，胡秀芳，梁宗锁，吕洪飞，杨东风，贾巧君，丁先锋，陈羽迪，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33