本发明专利技术提供一种抗肝癌基因药物组合物，包含安全、有效量的反义ｆｕｐ１基因和／或小分子干扰ＲＮＡ，及药学上可接受的辅剂。其中所述反义ｆｕｐ１基因具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示ＤＮＡ序列，所述小分子干扰ＲＮＡ包含序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示ＲＮＡ序列。还提供采用ａｍｂｉｏｎ网站提供的ＲＮＡｉ设计软件，针对ｆｕｐ１的编码区设计小分子干扰ＲＮＡ的抗肝癌基因药物筛选方法。进一步提供包含序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示ＲＮＡ序列的抗肝癌小分子。本发明专利技术以在肝癌细胞中高表达的基因ｆｕｐ１为药靶，针对其基因序列设计拮抗分子，为肝癌的基因治疗提供了有力的武器，并为进一步筛选抗肝癌的基因药物提供了很好的筛选平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗，具体涉及肝癌的基因治疗药物及其筛选方法。
技术介绍
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝炎和肝癌的高发病国家，全世界肝癌患者的48％集中在我国。近20年来我国肝癌的发病率上升了近40％，居恶性肿瘤中的第三位。肝癌的早期诊断非常困难，而手术后的复发率高达50％，肝癌的死亡率在我国仅次于胃癌。已有的研究结果表明，肝癌的发生与肝炎病毒(HBV，HCV)感染、肝硬化、黄曲霉素B1以及一些遗传因子密切相关。与其它组织来源的肿瘤相似，肝癌的发生发展同样是多阶段多步骤的过程，肿瘤的发生经常与致癌基因的过表达和抑癌基因的沉默有关。目前已经证明与人类肝癌的发生相关的一切基因如p21、p53、Ras、Raf、c-Myc(Naka T，Toyota N，Kaneko T，Kaibara N.AnticancerRes，199818555-564.Fujimoto Y，Hampton LL，Wirth PJ，Wang NJ，XieJP，Thorgeirsson SS.Cancer Res.1994 Jan 1；54(1)281-5.)等，牵涉多条信号传导途径；但其中尚未发现一个为肝癌发生过程所独有或在大量样品中拥有显著的检出率者，例如ras癌基因在肝癌中发生变异的检出率仅为10-25％，抑癌基因p53的变异在肝癌样品中的检出率也只有30-50％。为了研究与肝癌相关的基因表达，本专利技术者选取来自肝癌组织和正常肝组织的RNA为模板，分别逆转录放射性cDNA探针后，用之杂交固定有人类基因(EST)的尼龙膜。杂交结果经放射自显影后将图像通过专用软件GDA处理后，我们发现一个EST(Gemome System克隆号Hs15496)在肝癌组织样品中高表达而在正常肝组织样品中无表达(ratio值为99.9999，为对比之最大值)，差异十分显著。然后根据已知的EST Hs15496的序列分别合成上下游引物，以人肝细胞cDNA文库中抽提的质粒为模板对该片段进行了扩增，并随即进行了放射性同位素标记，用于人肝细胞cDNA文库的杂交筛选。通过两轮筛选，将阳性克隆进行了DNA序列测定。用测序获得的较长的cDNA片段对GenBank数据库进行查询，发现该基因的全长cDNA序列此时已经登录。该基因在GenBank的注册号(GI)为11434794，其cDNA全长为1233bp，由STS定位于第14号染色体上，在数据库中被称为假想蛋白FLJ10648(hypothetical proteinFLJ10648)。经比较，通过cDNA文库筛选所获得的cDNA片段的核苷酸序列与该假想蛋白的C端序列完全一致。检索结果发现，该基因仅仅是编码序列被报道，相关的功能研究仍是空白，故我们将其命名为fup1(function-unknownprotein 1)(见序列表中SEQ ID NO1，其中下划线表示fup1基因上游的结合位点，大写字母表示fup1基因的开放阅读框(ORF))。分别采用带有BamHI和EcoRI切割位点的上下游引物，以人肝细胞cDNA文库中抽提的质粒为模板，通过PCR扩增得到目的基因fup1和反义fup1基因(见序列表中SEQ ID NO2)。以上fup1基因和反义fup1基因的PCR产物分别经EcoRI和BamHI处理后，根据其引物两端酶切位点的差异，采用双粘性末端连接，定向插入用相同核酸内切酶处理的pcDNA3真核表达载体内。经DNA测序鉴定，其正反向序列与GenBank中登录的序列数据完全一致。经采用Sim4软件将fup1 cDNA序列与最新的人第14号染色体基因组DNA序列数据进行比较，发现包含fup1基因的DNA序列全长为7415bp；其开放阅读框(ORF)由3个外显子(起始碱基数分别是1-82，1115-2194和7345-7415)组成，编码一个含有410个氨基酸残基的蛋白。经TESS软件分析，FUP1基因的上游启动子区域中除了AP-1、TFIID、GATA等在真核细胞中常见转录因子结合位点外，还含有在肝脏中多见的AFP-1、C/EBP-β和HNF-4等转录因子的结合位点。这些转录因子的存在表明该基因的表达可能具有组织特异性。编码fup1基因的长度约为7.5kb的DNA序列位于一个更大的、长度约为45kb的mRNA前体上。经过转录和剪切后，该段前体所对应的成熟的mRNA可由一段cDNA序列来表示。在这段长度为2548bp的cDNA上，第306位至1538位碱基构成了FUP1的ORF，其5’和3’方向各有一段由305和1010个核苷酸构成的非翻译区域。本专利技术者进一步测定了fup1基因在人类细胞株中的分布。采用人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721和BEL 7404，抽提这些细胞的总RNA，在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳，然后将变性RNA转移至尼龙膜上。采用随机掺入法制备放射性探针，将标记好的fup1特异性探针和β-actin内参探针杂交固定有人类肝癌细胞株RNA的尼龙膜。Northern Blots结果显示fup11基因在所检测的4种人类肝癌细胞株中都有高表达，表达量远高于正常肝组织。将fup1基因克隆到带FLAG标签的重组载体上，瞬时转染小鼠成纤维细胞NIH3T3，发现转染72小时后表达fup1的细胞在核内显示出很强的荧光信号，说明fup1蛋白定位于细胞核内。九十年代初期发现21到28个核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。但直到1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马塞诸塞大学癌症中心的Mello首次将双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反义链都要强的靶向专一性的基因表达沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)。随后许多研究者先后采用不同长度的dsRNA使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳动物等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为RNA干扰技术(RNAi技术)(Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002；418(6894)244-51)。由于能够作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，所以可以毫不夸张地说，RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐，为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。科学家们逐渐意识到，将这项新颖的技术，应用于疾病治疗上可能具有莫大的潜力。如果进一步证实这种技术在人体内有效，将为许多疾病和感染提供新疗法。相对与其它的基因治疗手段如腺病毒、逆转录病毒等方法RNA干扰技术具有安全性高、用量低等优点。然而，目前并未发现用RNAi进行肝癌治疗的报道。本专利技术者基于fup1基因在各种肝癌细胞株中高表达的发现，进行了大量潜心研究，并将RNA干扰技术应用到fup1基因体内外表达的研究上，试验了RNAi技术治疗肝癌的可能性，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供抗肝癌基因药物组合物。本专利技术的另一个目的是提供抗肝癌基因药物的筛选方法，用以筛选拮抗肝癌高表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗肝癌基因药物组合物，包含安全、有效量的反义ｆｕｐ１基因和／或小分子干扰ＲＮＡ，及药学上可接受的辅剂。
【技术特征摘要】
1.一种抗肝癌基因药物组合物，包含安全、有效量的反义fup1基因和/或小分子干扰RNA，及药学上可接受的辅剂。2.如权利要求1所述的基因药物组合物，其中所述的反义fup1基因具有序列表中SEQ ID NO2所示DNA序列。3.如权利要求1所述的基因药物组合物，其中所述的小分子干扰RNA具有序列表中SEQ ID NO3所示RNA序列。4.如权利要求1所述的基因药物，其中所述反义fup1...
【专利技术属性】
技术研发人员：周庆玮，张倩，朱俊，潘巍，金由辛，甘人宝，李载平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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